0 引言

　　免疫熒光分析技術(shù)是新發(fā)展起來(lái)的精密的免疫標(biāo)記檢測(cè)技術(shù),，與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫法及金標(biāo)法相比，免疫熒光分析技術(shù)靈敏度高,，特異性強(qiáng),，操作方便，不用放射性物質(zhì)作為標(biāo)記物,，因此具有無(wú)放射性,、標(biāo)記物穩(wěn)定、便于長(zhǎng)期保存,、試驗(yàn)重復(fù)性好,、分析速度快、樣品用量少及標(biāo)準(zhǔn)曲線量程寬等優(yōu)點(diǎn)[1],。熒光分析法是測(cè)定物質(zhì)吸收了一定頻率的光以后,，物質(zhì)本身所發(fā)射的光的強(qiáng)度。熒光的強(qiáng)度與物質(zhì)數(shù)量之間存在正比關(guān)系,，可通過(guò)測(cè)定熒光的光譜和熒光強(qiáng)度,，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的分析。免疫熒光分析技術(shù)是目前生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中常用的快速分析技術(shù),，在微生物,、病毒抗原或抗體檢測(cè)、激素檢測(cè),、腫瘤標(biāo)志物檢測(cè),、毒品海洛因,、嗎啡、搖頭丸,、氯胺酮等檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景,。

1 免疫熒光定量檢測(cè)原理

　　將特異的熒光抗體先固體于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端滴加樣品后,，由于毛細(xì)管作用,，樣品將沿著該膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至固定有抗體的區(qū)域時(shí),，樣品中相應(yīng)的抗原即與該熒光體發(fā)生特異性結(jié)合,，隨著進(jìn)一步的層析作用，用此抗原的另一個(gè)抗體對(duì)此復(fù)合物進(jìn)行捕捉,，多余的熒光抗體用其二抗進(jìn)行捕捉,，兩次捕捉的位置分別稱為質(zhì)控線（C線）和檢測(cè)線（T線）。當(dāng)光源照射到檢測(cè)卡上時(shí),，質(zhì)控線和檢測(cè)線分別激發(fā)出不同強(qiáng)度的熒光,，光電轉(zhuǎn)換器接收不同強(qiáng)度的熒光產(chǎn)生不同大小的電信號(hào)，電信號(hào)的強(qiáng)弱反映出待檢測(cè)物的濃度,，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷,。

2 免疫熒光定量分析儀系統(tǒng)設(shè)計(jì)

　　免疫熒光定量分析儀主要由光學(xué)部分、硬件電路部分以及系統(tǒng)軟件部分組成,。光學(xué)部分是熒光定量分析儀的核心部分,，用來(lái)激發(fā)出熒光，而硬件電路部分和系統(tǒng)軟件部分則用來(lái)進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)處理以及控制整個(gè)儀器的正常運(yùn)行,。

　　2.1 光學(xué)部分設(shè)計(jì)

　　光學(xué)部分設(shè)計(jì)如圖1所示,，光學(xué)部分由光源發(fā)射光路和熒光檢測(cè)光路兩部分組成。

　　光源發(fā)射光路由LED光源,、凸透鏡1,、濾光片1和凸透鏡2組成。LED光源的光軸與凸透鏡1,、濾光片1以及凸透鏡2的光軸在一條線上,。光源為綠色(中心波長(zhǎng)為580 nm)高亮度LED光源，LED位于發(fā)射光路凸透鏡1的焦點(diǎn),，這樣光源發(fā)出的光經(jīng)凸透鏡1后變?yōu)槠叫泄?，濾光片1采用中心波長(zhǎng)580 nm帶寬為30 nm的窄帶干涉濾光片，平行光經(jīng)過(guò)濾光片1后,，入射光中565 nm～595 nm范圍以外的光被濾除掉,，出射的光為窄帶光(565 nm～595 nm)，其經(jīng)過(guò)凸透鏡2后,，被聚焦到樣品上,，激發(fā)出熒光,，熒光波長(zhǎng)為610 nm。

　　熒光檢測(cè)光路由凸透鏡3,、濾光片2,、凸透鏡4和光電轉(zhuǎn)換器組成。光電轉(zhuǎn)換器與凸透鏡3,、濾光片2,、凸透鏡4的光軸在一條線上。熒光檢測(cè)光路光軸和發(fā)射光路光軸成45°角,，最大程度地減少了激發(fā)光對(duì)熒光信號(hào)檢測(cè)的影響,。熒光檢測(cè)光路光軸和發(fā)射光路光軸的交點(diǎn)在檢測(cè)試紙上，且交點(diǎn)為凸透鏡2和凸透鏡3的焦點(diǎn),。濾光片2采用中心波長(zhǎng)610 nm,，帶寬為15 nm的窄帶干涉濾光片。激發(fā)出的熒光被凸透鏡3收集后變?yōu)槠叫泄?，平行光通過(guò)濾光片2后,，原來(lái)的少量激發(fā)光會(huì)被濾光片濾除掉，僅剩激發(fā)出的610 nm左右的熒光信號(hào)通過(guò)[2-3],。通過(guò)濾光片后的光被凸透鏡4收集聚焦到熒光檢測(cè)模塊上的光電轉(zhuǎn)換器上,，實(shí)現(xiàn)光信號(hào)到電信號(hào)的轉(zhuǎn)換。

　　2.2 系統(tǒng)硬件電路部分設(shè)計(jì)

　　系統(tǒng)硬件電路的結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示,，儀器的測(cè)量原理是：處理器控制步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)待檢測(cè)樣本到達(dá)檢測(cè)器的檢測(cè)口上方,，通過(guò)發(fā)光控制模塊控制LED的發(fā)光強(qiáng)度以符合測(cè)量的強(qiáng)度要求，光電傳感器檢測(cè)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱,，傳感器輸出信號(hào)經(jīng)放大和濾波處理后進(jìn)入ADS1252轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)交給處理器進(jìn)行處理[4]。

　　圖2中檢測(cè)器框中所示的部分包括上文2.1所描述的光學(xué)部分以及部分硬件電路,，兩部分共同封裝在檢測(cè)器內(nèi),，提高了檢測(cè)信號(hào)的穩(wěn)定性和抗干擾能力。檢測(cè)器硬件電路部分由發(fā)光控制模塊和熒光檢測(cè)模塊組成,。

　　為了保證光源的穩(wěn)定性,，發(fā)光控制模塊采用了恒流源驅(qū)動(dòng)方式，這樣可以有效保證光源發(fā)光強(qiáng)度的恒定,。對(duì)于有的樣品,，照射光源不宜太強(qiáng)，因此,，恒流源采用的是程控調(diào)節(jié)的恒流源,，通過(guò)輸入不同的數(shù)字值，可以控制LED的發(fā)光強(qiáng)度,。即LED驅(qū)動(dòng)電流的大小可以通過(guò)程序進(jìn)行控制,。

　　光電轉(zhuǎn)換器選用內(nèi)置運(yùn)放的光電轉(zhuǎn)換芯片OPT101,。熒光檢測(cè)模塊包含了光電轉(zhuǎn)換、信號(hào)放大濾波,、電壓偏置,、模/數(shù)轉(zhuǎn)換等部分。其中,，信號(hào)放大采用程控放大,，模/數(shù)轉(zhuǎn)換采用24位的A/D轉(zhuǎn)換芯片ADS1252，可保證足夠的轉(zhuǎn)換精度和大的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍,。檢測(cè)器傳輸給控制器的是數(shù)字電信號(hào),，數(shù)字信號(hào)比模擬信號(hào)有更強(qiáng)的抗干擾能力和準(zhǔn)確性，這就大大提高了系統(tǒng)的檢測(cè)精度,。

　　2.3 系統(tǒng)軟件部分設(shè)計(jì)

　　系統(tǒng)軟件使用C語(yǔ)言進(jìn)行編寫(xiě),，軟件流程圖如圖3所示。系統(tǒng)初始化主要完成系統(tǒng)各外圍模塊的配置以及歷史設(shè)置的讀取和配置,。待系統(tǒng)初始化完成后,，控制電機(jī)帶動(dòng)樣品卡卡槽出倉(cāng)，并在顯示屏上提示用戶插入檢測(cè)樣品卡,。系統(tǒng)循環(huán)檢測(cè)樣品卡是否插入卡槽內(nèi),，當(dāng)檢測(cè)到樣品卡插入后系統(tǒng)打開(kāi)二維碼掃描槍并控制電機(jī)帶動(dòng)樣品卡移動(dòng)至掃描槍處進(jìn)行二維碼的讀取。二維碼包含檢測(cè)項(xiàng)目,、產(chǎn)品批號(hào),、標(biāo)準(zhǔn)曲線等信息。系統(tǒng)判斷二維碼信息有效后打開(kāi)LED并根據(jù)二維碼相關(guān)信息調(diào)整LED亮度同時(shí)控制電機(jī)帶動(dòng)待檢測(cè)樣本移動(dòng)至檢測(cè)器上方進(jìn)行檢測(cè),。采集到的數(shù)據(jù)將以txt文件的形式保存在SD卡內(nèi),，經(jīng)一定的算法計(jì)算出T線與C線對(duì)應(yīng)波峰的面積比后代入二維碼信息中的標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)，得出待檢測(cè)樣品的濃度并將最終的熒光強(qiáng)度曲線及樣品的濃度檢測(cè)結(jié)果顯示到顯示屏上并自動(dòng)存儲(chǔ)和打印檢測(cè)信息[5],。

3 測(cè)試結(jié)果及分析

　　本文設(shè)計(jì)的免疫熒光定量分析儀可以測(cè)量血液和尿液中多種物質(zhì)的濃度,，本文以NT-proBNP（N末端腦鈉肽前體）的濃度測(cè)量為例對(duì)儀器的運(yùn)行效果進(jìn)行分析。NT-proBNP是由心臟分泌的一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素 ,，已被證明是臨床上診斷,、治療及判斷心力衰竭患者預(yù)后的重要指標(biāo)[6]。

　　3.1 熒光信號(hào)的采集

　　將樣品卡插到儀器的卡槽內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)得到熒光強(qiáng)度曲線如圖4所示,。圖中橫坐標(biāo)代表數(shù)據(jù)個(gè)數(shù),，縱坐標(biāo)代表光電轉(zhuǎn)換器輸出的電壓值，單位為mV,。

　　3.2 標(biāo)準(zhǔn)直線擬合

　　得到樣品熒光強(qiáng)度的曲線后,，利用高斯擬合可以計(jì)算出T線和C線對(duì)應(yīng)的曲線波峰的面積，利用T線和C線對(duì)應(yīng)波峰的面積可以計(jì)算出待檢測(cè)樣品的濃度。這就需要一組標(biāo)準(zhǔn)濃度校驗(yàn)品,，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度校驗(yàn)品的測(cè)量結(jié)果,，建立一定的數(shù)學(xué)模型計(jì)算出T線和C線對(duì)應(yīng)波峰的面積與樣品濃度之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。

　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)濃度校驗(yàn)品得到樣品濃度與T線對(duì)應(yīng)波峰的面積（用AT表示）與C線對(duì)應(yīng)波峰的面積（用AC表示）之比AT/AC的對(duì)應(yīng)關(guān)系如表1所示,。

　　由表1中的對(duì)應(yīng)關(guān)系,，利用最小二乘法得到的樣品濃度與AT/AC數(shù)學(xué)量化關(guān)系，如圖5所示,。

　　由圖5可以得出,，最小二乘法擬合直線的表達(dá)式如式1所示：

　　y=9 912.156x-84.742 8(1)

　　直線擬合相關(guān)系數(shù)R=0.999 92，說(shuō)明這6種標(biāo)準(zhǔn)濃度校驗(yàn)品的濃度與AT/AC之間存在良好的線性關(guān)系,。

　　3.3 系統(tǒng)測(cè)量誤差分析

　　選擇一組同一批次不同濃度標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品,，依據(jù)式1對(duì)樣品濃度進(jìn)行測(cè)量，分析系統(tǒng)的檢測(cè)誤差,，得到的測(cè)量結(jié)果如表2所示,。

　　由表2的實(shí)測(cè)結(jié)果可以看出，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)濃度樣品的測(cè)量誤差在±8%以內(nèi),，滿足實(shí)際的使用要求,。下面選取一組醫(yī)院的病人血液樣品，以進(jìn)口的銳普智能熒光干式定量分析儀作為標(biāo)準(zhǔn)儀器進(jìn)行對(duì)比測(cè)量,。每個(gè)病例取75 L病人血液樣本加到樣品緩沖液中,，將溶液充分混勻后取75 ?滋L混勻后的樣本滴加到樣品卡的加樣孔內(nèi)，等待15 min后將樣品卡插入到儀器的卡槽內(nèi)得到的測(cè)量結(jié)果如表3所示,。

　　由表3的對(duì)比測(cè)量結(jié)果可以看出,，本文設(shè)計(jì)的免疫熒光定量分析儀與現(xiàn)已商品化的免疫熒光檢測(cè)儀相比，測(cè)量誤差在±8%以內(nèi),，能滿足臨床應(yīng)用要求,。

4 結(jié)論

　　本文設(shè)計(jì)了免疫熒光定量分析儀，對(duì)儀器的光學(xué)部分,、硬件電路部分以及系統(tǒng)軟件部分進(jìn)行了詳細(xì)介紹,。從多個(gè)角度對(duì)儀器的運(yùn)行結(jié)果進(jìn)行了分析，從測(cè)試結(jié)果可以看出,，儀器可以擬合出線性度良好的標(biāo)準(zhǔn)直線,，通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)校驗(yàn)品的測(cè)量試驗(yàn)和與標(biāo)準(zhǔn)儀器的對(duì)比試驗(yàn)表明儀器在小型化,、快速性的基礎(chǔ)上,，測(cè)量誤差能夠控制在±8%以內(nèi)，可以滿足臨床應(yīng)用的要求,。

參考文獻(xiàn)

　　[1] 黃曉群.酶聯(lián)免疫法,、金標(biāo)法、時(shí)間分辨免疫熒光分析法測(cè)定HBsAg對(duì)比分析[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng)：臨床醫(yī)學(xué)學(xué)刊，2009,，18(10)：7-9.

　　[2] 紀(jì)建偉,，解飛，HARBINSON J．LED激發(fā)光源葉綠素?zé)晒鈪?shù)在線監(jiān)控系統(tǒng)[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),，2009,，25(4)：145-149.

　　[3] 張可可，閆星魁,，陳世哲.熒光法海水葉綠素a傳感器設(shè)計(jì)[J].山東科學(xué),，2013，26(3)：37-40.

　　[4] 王宜懷,，吳瑾,，蔣銀珍.嵌入式系統(tǒng)原理與實(shí)踐：ARM Cortex-M4 Kinetis微控制器[M].北京：電子工業(yè)出版社，2012.

　　[5] 熊有鄭,，閔小平,，葛勝祥.基于嵌入式Linux的掃描式熒光檢測(cè)儀的實(shí)現(xiàn)[J].工業(yè)控制計(jì)算機(jī)，2013,，26(9)：9-10,，13.

　　[6] 史曉敏，林箐,，徐國(guó)賓.血清N末端B型鈉尿肽原在心功能評(píng)價(jià)及慢性充血性心力衰竭診斷中的初步應(yīng)用[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,，2005，28(1)：37-41.