The Challenge:
開發(fā)一個(gè)比傳統(tǒng)系統(tǒng)更加易于使用的,，易于攜帶的，并且成本更低廉的小型熱循環(huán)儀,。
The Solution:
使用NI公司的CompactDAQ硬件系統(tǒng)和LabVIEW軟件來(lái)創(chuàng)建小型熱循環(huán)儀,，并且憑借USB接口的即插即用功能,，以執(zhí)行實(shí)時(shí)的聚合酶鏈反應(yīng)。
Author(s):
Hsieh Tseng Ming James - Institute of Bioengineering and Nanotechnology, A-Star
聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）熱循環(huán)是進(jìn)行分子診斷的黃金準(zhǔn)則,。然而,，在應(yīng)對(duì)流感大流行方面，全球所面臨的主要挑戰(zhàn)是只有專業(yè)人員才能進(jìn)行有效的診斷測(cè)試。此外,，商業(yè)上可用的熱循環(huán)儀也只能用于實(shí)驗(yàn)室環(huán)境使用,，因此，我們很難對(duì)其進(jìn)行操作,，要將商用熱循環(huán)儀的應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)大到緊急情況下,，以及公共檢測(cè)站，例如機(jī)場(chǎng),，其笨重且昂貴的特性無(wú)疑是一個(gè)障礙,。因此，迫切需要我們開發(fā)一種便宜的,，可攜帶的,，且可任意使用的分子診斷工具。
為了提供靈活的,，成本低廉的診斷系統(tǒng),，我們?cè)谛录悠律锕こ毯图{米技術(shù)研究所的研究小組開發(fā)了一個(gè)小型診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)采用美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心（CDC）所推薦的PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)傳染性急病,。我們的系統(tǒng)從實(shí)時(shí)PCR到病毒基因目標(biāo)鏈的檢測(cè)對(duì)整個(gè)診斷過(guò)程進(jìn)行整合與自動(dòng)化,，以執(zhí)行數(shù)據(jù)的分析。
通過(guò)使用NI 公司的CompactDAQ硬件系統(tǒng),，以及用于控制和數(shù)據(jù)分析的LabVIEW圖形化系統(tǒng)設(shè)計(jì)軟件作為我們的解決方案,，我們創(chuàng)建了一個(gè)小型且便攜式的系統(tǒng)。該系統(tǒng)由一個(gè)較小的珀?duì)柼鳎囟妊b置）,，電源供應(yīng)器（能量裝置）,，和具有USB接口即插即用功能的光檢測(cè)器（光學(xué)裝置）構(gòu)成。
我們的熱循環(huán)儀是便攜式的,，完全自動(dòng)化的，且可用于在重要場(chǎng)合中大規(guī)模健康檢查的情況下使用,，例如在機(jī)場(chǎng)檢查站控制傳染性疾病的傳播,。系統(tǒng)自動(dòng)化是可靠診斷的一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)，因?yàn)榱鞲写罅餍锌赡軙?huì)在偏遠(yuǎn)地區(qū)發(fā)生,，那里可能沒(méi)有受過(guò)專業(yè)訓(xùn)練的人員處理試驗(yàn)樣品,。此外，系統(tǒng)自動(dòng)化的實(shí)現(xiàn)大大降低了人力和培訓(xùn)費(fèi)用,。
利用該系統(tǒng)同時(shí)運(yùn)行包含預(yù)加載PCR反應(yīng)物的三個(gè)聚合物,，從抽樣到結(jié)果所花費(fèi)時(shí)間不到一小時(shí)，并且允許采用大量生物的多樣性,。利用熱敏電阻的實(shí)時(shí)溫度反饋,，一個(gè)內(nèi)部比例積分微分(PID)芯片來(lái)處理溫度控制。該控制器由一個(gè)補(bǔ)償器，輸出裝置和傳感器反饋信號(hào)組成,，反饋信號(hào)對(duì)于控制加熱器輸出功率,，以及保持溫度是很必要的。使用LabVIEW軟件,，我們對(duì)圖形用戶接口進(jìn)行編程,，以顯示實(shí)時(shí)溫度，設(shè)置溫度,，并且顯示來(lái)自三個(gè)通道的實(shí)時(shí)PCR結(jié)果 (如圖1A所示),。
系統(tǒng)配置
整個(gè)集成系統(tǒng)的配置包括執(zhí)行PCR系統(tǒng)運(yùn)行和反應(yīng)的循環(huán)溫控系統(tǒng)、固定安裝的三個(gè)藍(lán)色LED光源,、排布于LED至光電倍增管(PMT)光路之間用于實(shí)時(shí)光學(xué)探測(cè)的相關(guān)透鏡和濾波器,。系統(tǒng)中包括一組銅制或黃銅制的加熱室，與放置樣本的聚合體反應(yīng)室集成在一起,。
LabVIEW是系統(tǒng)構(gòu)架的核心,，中心處理器單元的設(shè)計(jì)專門針對(duì)執(zhí)行由LabVIEW預(yù)編寫的指令，可用于控制系統(tǒng)啟動(dòng)和健康檢查,、PCR運(yùn)行的熱量循環(huán)控制,、和多路復(fù)用熒光信號(hào)的光學(xué)檢測(cè)。
在PCR處理的循環(huán)溫控過(guò)程中,，系統(tǒng)于退火循環(huán)的最后一秒進(jìn)行光學(xué)檢測(cè),。三個(gè)LED同時(shí)由來(lái)自NI 9265模擬輸出模塊的電流驅(qū)動(dòng)依次點(diǎn)亮，每個(gè)LED持續(xù)發(fā)光200 ms,，在下一個(gè)LED燈點(diǎn)亮前熄滅當(dāng)前LED燈,。
特殊設(shè)計(jì)的裝置用于聚焦和引導(dǎo)LED光路傳輸。光在照射到放置DNA樣本的反應(yīng)室之前要先通過(guò)一個(gè)濾波器,。光線在到達(dá)PMT之前還需通過(guò)一系列透鏡和濾波器,，最后由NI 9206模擬輸入模塊讀出該信號(hào)。
我們使用LabVIEW來(lái)進(jìn)行信號(hào)處理以獲取數(shù)據(jù)集的均值,，來(lái)自PMT的信號(hào)被放大并處理,。之后將向用戶顯示數(shù)據(jù)，并通過(guò)主用戶菜單將該數(shù)據(jù)連續(xù)更新于三個(gè)獨(dú)立的曲線圖中(見(jiàn)圖2),。
PCR混合物被置于聚碳酸酯PCR反應(yīng)室中,，并加油以防止蒸發(fā)。PCR在以下溫度條件下完成：95 °C下持續(xù)20秒(Taq聚合酶活化) ,、50 次循環(huán)的放大(在95 °C下保持5秒進(jìn)行加熱變性,、在60 °C保持60秒進(jìn)行退火和延伸)。LabVIEW程序記錄每次循環(huán)中DNA復(fù)制發(fā)出的熒光,。
穩(wěn)定性和重用性
在分子診斷中,，PCR是一種將特定DNA片段放大至分子級(jí)別的常用方法,。在實(shí)現(xiàn)過(guò)程中，需要在94 °C下進(jìn)行40至50次循環(huán)的熱變,，在60 °C下進(jìn)行退火,，在60 °C下進(jìn)行延伸。整個(gè)過(guò)程的關(guān)鍵點(diǎn)在于精確的溫度控制,，保持2 °C/s的溫度上升率,，以避免產(chǎn)生或放大錯(cuò)誤的DNA序列。
我們使用LabVIEW來(lái)控制獨(dú)立的高端和低端參考輸出通道,，并采用一塊由高速金屬氧化物半導(dǎo)體場(chǎng)效應(yīng)晶體管(MOSFET)組成的電路,，設(shè)計(jì)并制造了片上加熱方案，實(shí)現(xiàn)了PWM實(shí)時(shí)控制,。溫度測(cè)量顯示,，我們獲得的加溫和冷卻率分別為2.5 °C/s和2.2 °C/s。對(duì)于每一路的溫度設(shè)置,，過(guò)沖小于1 °C,，并且穩(wěn)定性保持在±0.1 °C。
結(jié)果與結(jié)論
我們使用1至104的TaqMan探針,，通過(guò)連續(xù)稀釋的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)互補(bǔ)DNA(cDNA) 來(lái)確認(rèn)PCR的實(shí)時(shí)探測(cè)性能,。結(jié)果證實(shí)，從Ct曲線中確定的敏感度與市場(chǎng)上的實(shí)時(shí)熱循環(huán)儀(圖1B)性能相當(dāng),。
與市面上其它的熱循環(huán)儀相比,，我們的系統(tǒng)更緊湊、便攜性更高,，且恒溫性更好(表1),。系統(tǒng)的便攜性使其在大范圍流感爆發(fā)的早期發(fā)揮更大的作用。同時(shí),，該診斷系統(tǒng)非常適合在門診,、急診室、公共檢查站點(diǎn)等地使用,。此外,，由于其便攜性好、價(jià)格低,、體積小、且使用方便等特點(diǎn),，該熱循環(huán)儀在食品安全方面具有潛在的優(yōu)勢(shì),。
參考文獻(xiàn)
1. J. Felbel, I. Bieber, J. M. Kohler, Chemical Surface Management for Micro PCR in Silicon Chip Thermocyclers, Proc. SPIE, 4937, 34-40, 2002.
2. S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Kohler, G. Mayer, A. Siebert, D. Schimkat, Temperature Controlled Chip Reactor for Rapid PCR, 2002.