The Challenge:
開發(fā)一個比傳統(tǒng)系統(tǒng)更加易于使用的,，易于攜帶的，并且成本更低廉的小型熱循環(huán)儀,。
The Solution:
使用NI公司的CompactDAQ硬件系統(tǒng)和LabVIEW軟件來創(chuàng)建小型熱循環(huán)儀,，并且憑借USB接口的即插即用功能,，以執(zhí)行實時的聚合酶鏈反應,。
Author(s):
Hsieh Tseng Ming James - Institute of Bioengineering and Nanotechnology, A-Star
聚合酶鏈反應（PCR）熱循環(huán)是進行分子診斷的黃金準則。然而,，在應對流感大流行方面,，全球所面臨的主要挑戰(zhàn)是只有專業(yè)人員才能進行有效的診斷測試。此外,，商業(yè)上可用的熱循環(huán)儀也只能用于實驗室環(huán)境使用,，因此，我們很難對其進行操作,，要將商用熱循環(huán)儀的應用領域擴大到緊急情況下,，以及公共檢測站，例如機場,，其笨重且昂貴的特性無疑是一個障礙,。因此，迫切需要我們開發(fā)一種便宜的,，可攜帶的,，且可任意使用的分子診斷工具。
為了提供靈活的,，成本低廉的診斷系統(tǒng),，我們在新加坡生物工程和納米技術研究所的研究小組開發(fā)了一個小型診斷系統(tǒng)，該診斷系統(tǒng)采用美國疾病控制和預防中心（CDC）所推薦的PCR技術來檢測傳染性急病,。我們的系統(tǒng)從實時PCR到病毒基因目標鏈的檢測對整個診斷過程進行整合與自動化,，以執(zhí)行數據的分析。
通過使用NI 公司的CompactDAQ硬件系統(tǒng),，以及用于控制和數據分析的LabVIEW圖形化系統(tǒng)設計軟件作為我們的解決方案,，我們創(chuàng)建了一個小型且便攜式的系統(tǒng)。該系統(tǒng)由一個較小的珀爾帖器（溫度裝置）,，電源供應器（能量裝置），和具有USB接口即插即用功能的光檢測器（光學裝置）構成,。
我們的熱循環(huán)儀是便攜式的,，完全自動化的，且可用于在重要場合中大規(guī)模健康檢查的情況下使用,，例如在機場檢查站控制傳染性疾病的傳播,。系統(tǒng)自動化是可靠診斷的一個關鍵優(yōu)勢，因為流感大流行可能會在偏遠地區(qū)發(fā)生,，那里可能沒有受過專業(yè)訓練的人員處理試驗樣品,。此外，系統(tǒng)自動化的實現大大降低了人力和培訓費用,。
利用該系統(tǒng)同時運行包含預加載PCR反應物的三個聚合物,，從抽樣到結果所花費時間不到一小時,，并且允許采用大量生物的多樣性。利用熱敏電阻的實時溫度反饋,，一個內部比例積分微分(PID)芯片來處理溫度控制,。該控制器由一個補償器，輸出裝置和傳感器反饋信號組成,，反饋信號對于控制加熱器輸出功率,，以及保持溫度是很必要的。使用LabVIEW軟件,，我們對圖形用戶接口進行編程,，以顯示實時溫度，設置溫度,，并且顯示來自三個通道的實時PCR結果 (如圖1A所示),。
系統(tǒng)配置
整個集成系統(tǒng)的配置包括執(zhí)行PCR系統(tǒng)運行和反應的循環(huán)溫控系統(tǒng)、固定安裝的三個藍色LED光源,、排布于LED至光電倍增管(PMT)光路之間用于實時光學探測的相關透鏡和濾波器,。系統(tǒng)中包括一組銅制或黃銅制的加熱室，與放置樣本的聚合體反應室集成在一起,。
LabVIEW是系統(tǒng)構架的核心,，中心處理器單元的設計專門針對執(zhí)行由LabVIEW預編寫的指令，可用于控制系統(tǒng)啟動和健康檢查,、PCR運行的熱量循環(huán)控制,、和多路復用熒光信號的光學檢測。
在PCR處理的循環(huán)溫控過程中,，系統(tǒng)于退火循環(huán)的最后一秒進行光學檢測,。三個LED同時由來自NI 9265模擬輸出模塊的電流驅動依次點亮，每個LED持續(xù)發(fā)光200 ms,，在下一個LED燈點亮前熄滅當前LED燈,。
特殊設計的裝置用于聚焦和引導LED光路傳輸。光在照射到放置DNA樣本的反應室之前要先通過一個濾波器,。光線在到達PMT之前還需通過一系列透鏡和濾波器,，最后由NI 9206模擬輸入模塊讀出該信號。
我們使用LabVIEW來進行信號處理以獲取數據集的均值,，來自PMT的信號被放大并處理,。之后將向用戶顯示數據，并通過主用戶菜單將該數據連續(xù)更新于三個獨立的曲線圖中(見圖2),。
PCR混合物被置于聚碳酸酯PCR反應室中,，并加油以防止蒸發(fā)。PCR在以下溫度條件下完成：95 °C下持續(xù)20秒(Taq聚合酶活化) 、50 次循環(huán)的放大(在95 °C下保持5秒進行加熱變性,、在60 °C保持60秒進行退火和延伸),。LabVIEW程序記錄每次循環(huán)中DNA復制發(fā)出的熒光。
穩(wěn)定性和重用性
在分子診斷中,，PCR是一種將特定DNA片段放大至分子級別的常用方法,。在實現過程中，需要在94 °C下進行40至50次循環(huán)的熱變,，在60 °C下進行退火,，在60 °C下進行延伸。整個過程的關鍵點在于精確的溫度控制,，保持2 °C/s的溫度上升率,，以避免產生或放大錯誤的DNA序列。
我們使用LabVIEW來控制獨立的高端和低端參考輸出通道,，并采用一塊由高速金屬氧化物半導體場效應晶體管(MOSFET)組成的電路,，設計并制造了片上加熱方案，實現了PWM實時控制,。溫度測量顯示,，我們獲得的加溫和冷卻率分別為2.5 °C/s和2.2 °C/s。對于每一路的溫度設置,，過沖小于1 °C,，并且穩(wěn)定性保持在±0.1 °C。
結果與結論
我們使用1至104的TaqMan探針,，通過連續(xù)稀釋的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)互補DNA(cDNA) 來確認PCR的實時探測性能,。結果證實，從Ct曲線中確定的敏感度與市場上的實時熱循環(huán)儀(圖1B)性能相當,。
與市面上其它的熱循環(huán)儀相比,，我們的系統(tǒng)更緊湊、便攜性更高,，且恒溫性更好(表1),。系統(tǒng)的便攜性使其在大范圍流感爆發(fā)的早期發(fā)揮更大的作用。同時,，該診斷系統(tǒng)非常適合在門診,、急診室、公共檢查站點等地使用,。此外，由于其便攜性好,、價格低,、體積小、且使用方便等特點，該熱循環(huán)儀在食品安全方面具有潛在的優(yōu)勢,。
參考文獻
1. J. Felbel, I. Bieber, J. M. Kohler, Chemical Surface Management for Micro PCR in Silicon Chip Thermocyclers, Proc. SPIE, 4937, 34-40, 2002.
2. S. Poser, T. Schulz, U. Dillner, V. Baier, J. M. Kohler, G. Mayer, A. Siebert, D. Schimkat, Temperature Controlled Chip Reactor for Rapid PCR, 2002.