自DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解析開始,，人們在探究健康與疾病基因組復(fù)雜性與差異性上付出巨大努力,，測序通量限制和高昂成本成為人們深入分析基因組的首要障礙，2005年推出高通量測序技術(shù)初步解決了這個問題,，人類基因組測序成本迅速下降,，由此產(chǎn)生一個新名詞：下一代測序(next-generation sequencing， NGS),。在過去十多年,，NGS不斷進(jìn)化，人類基因組測序成本已經(jīng)下降至1 000美元/人,。

　　一,、NGS技術(shù)平臺、發(fā)展趨勢及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

　　國內(nèi)臨床應(yīng)用短讀長NGS技術(shù)主要基于邊合成邊測序(sequencing-by-synthesis,， SBS)的Life平臺和Illumina平臺,。Life Ion-Torrent平臺采用單核糖核酸增加(single-nucleotide addition， SNA)方法,，Illumina平臺依賴于循環(huán)可逆終止(cyclic reversible termination,， CRT)技術(shù)。盡管短讀長NGS平臺總體準(zhǔn)確率較高(>98%),，但讀取高AT或高GC片段錯誤率仍差強(qiáng)人意,。由于基因組包含重復(fù)序列、結(jié)構(gòu)變異及拷貝數(shù)變化,，短讀長測序平臺解析這些信息存在固有缺陷,，近幾年相繼推出基于單分子測序和合成法測序第三代測序。PacBio Biosciences單分子實時測序,，其PacBio RS Ⅱ平均測序讀長10 000～15 000 bp,。2014年，另一種基于納米單分子測序技術(shù)原型機(jī)-MinION誕生,，平均測序讀長>10 000 bp,。合成法長讀長測序平臺發(fā)展有2個系統(tǒng)：Illumina長片段合成系統(tǒng)與10×Genomics乳液系統(tǒng)。第三代長讀長測序平臺單個堿基錯誤率較高,。

　　NGS技術(shù)廣泛應(yīng)用于常規(guī)臨床實踐,，應(yīng)用領(lǐng)域包括無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(noninvasive prenatal test,，NIPT)和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查(preimplantation genetic diagnosis/preimplantation genetic screening，PGD/PGS),、遺傳病,、腫瘤、藥物基因組等,。2014年6月,，國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)首個NGS診斷產(chǎn)品用于胎兒染色體非整倍體檢測,。NIPT是國內(nèi)NGS應(yīng)用最為成熟的領(lǐng)域,。NGS應(yīng)用于PGD/PGS優(yōu)點在于能夠利用單一平臺實現(xiàn)單基因病和染色體異常分析。2014年9月我國誕生世界首例應(yīng)用多重退火成環(huán)循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行胚胎全基因組擴(kuò)增NGS測序試管嬰兒,。隨著檢測費(fèi)用降低和基因解讀能力提高,，NGS應(yīng)用遺傳病特別是罕見病，已經(jīng)由基因組合向全外顯子測序(whole exome sequencing,，WES)和全基因組測序(whole genome sequencing,，WGS)轉(zhuǎn)變。2010年,，應(yīng)用WES技術(shù)僅通過4個病例WES即發(fā)現(xiàn)米勒綜合征致病基因DHODH,。2016年一項前瞻性研究評估證實單病例WES作為一線分子檢測技術(shù)用于新生兒單基因疾病診療臨床效用性。2016年另一項涉及54個國家1 000個家庭研究表明,，WGS對未確診疾病診斷率比經(jīng)典遺傳診斷方法還高,。

　　目前腫瘤NGS檢測主要應(yīng)用于遺傳性腫瘤綜合征篩查和體細(xì)胞突變分析。NGS使腫瘤防治措施前移至預(yù)防階段,。大量研究證實某些遺傳性腫瘤與關(guān)鍵基因突變相關(guān),，2017版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南指出可利用NGS檢測相關(guān)基因突變并行遺傳咨詢。如與遺傳性乳腺癌和卵巢癌,、林奇綜合征和神經(jīng)纖維瘤等相關(guān)高外顯率基因突變等,，此外還有一些中等外顯率和低外顯率基因。NGS在體細(xì)胞突變分析領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛,，通過NGS分析腫瘤起始,、發(fā)展和轉(zhuǎn)移階段遺傳變異及相關(guān)驅(qū)動突變和伴隨突變，有助于腫瘤患者分類,、預(yù)后,、靶向治療、耐藥性分析,。國際上相繼成立多個測序計劃致力于破譯癌癥細(xì)胞突變模式,。癌癥基因組計劃已經(jīng)發(fā)掘近500萬個腫瘤體細(xì)胞基因突變，并建立了全世界最大,、最廣泛的癌癥體細(xì)胞突變數(shù)據(jù)庫,。這些大量前期工作為后續(xù)NGS臨床應(yīng)用打下堅實基礎(chǔ),。如今臨床利用腫瘤熱點突變基因組合，可在1 d內(nèi)對幾百個腫瘤相關(guān)基因幾千個熱點突變位點進(jìn)行快速檢測,。

　　腫瘤液體活檢和單細(xì)胞測序是NGS應(yīng)用新方向,。腫瘤患者外周血含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)或者游離腫瘤DNA(circulating tumour DNA,，ctDNA),。CTC和ctDNA取材便利，適用于腫瘤個體化診斷,、預(yù)后,、復(fù)發(fā)風(fēng)險評估。2014年一項非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,，NSCLC)患者血漿ctDNA NGS檢測發(fā)現(xiàn),，對Ⅱ～Ⅳ期NSCLC檢測敏感性100%。由于常規(guī)測序樣品來源均是多細(xì)胞混合DNA,，得到的序列信息是一群細(xì)胞基因信息平均值,，或其中占優(yōu)勢數(shù)量細(xì)胞DNA信息，而單個細(xì)胞特性被忽視,。單細(xì)胞NGS測序能夠揭示細(xì)胞個體間差異,，可為腫瘤分子分型和個體化治療提供精細(xì)化指導(dǎo)，有助于準(zhǔn)確理解腫瘤內(nèi)部異質(zhì)性和腫瘤演進(jìn),。

　　越來越多證據(jù)表明,，在相關(guān)藥物代謝通路，編碼藥物代謝酶或相關(guān)蛋白基因遺傳變異決定個體藥物反應(yīng)或藥物敏感性,。不同患者對同一藥物毒性和療效有不同反應(yīng),。臨床藥物基因組學(xué)發(fā)展日新月異。截至目前,，美國食品藥品管理局公布了140余種藥物,，建議通過遺傳信息指導(dǎo)其合理使用，美國臨床遺傳藥理學(xué)應(yīng)用委員會發(fā)布了35個藥物臨床藥物基因組學(xué)應(yīng)用指南,。目前個體化用藥主要針對某種藥品開展一個或少數(shù)幾個基因分型篩查,。例如某些針對表皮生長因子受體靶向藥基因突變檢測、鉑類藥物相關(guān)敏感性基因檢測和細(xì)胞色素P450家族基因如CYP2D6分型檢測等,。影響藥物代謝或敏感性基因很多,，應(yīng)用NGS技術(shù)可以得到單個患者成百上千個基因分型結(jié)果，全面指導(dǎo)其用藥,。

　　二,、NGS技術(shù)臨床應(yīng)用質(zhì)控問題的現(xiàn)狀和解決辦法初探

　　NGS檢測比常規(guī)分子檢測復(fù)雜，實驗操作部分和生物信息分析部分包括眾多實驗處理和分析程序,。從樣本制備到數(shù)據(jù)分析,，NGS過程每一步都可能混入錯誤,。因此凸顯臨床檢測質(zhì)控重要性。2015年,，國家衛(wèi)生計生委臨床檢驗中心NGS檢測體細(xì)胞突變有效性室間質(zhì)評結(jié)果分析表明,，64家參評實驗室僅33家檢測性能達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)，只有17家實驗室能正確識別基因組合所有突變,，充分反映NGS檢測過程復(fù)雜性和制定統(tǒng)一檢測規(guī)范迫切性[12],。目前NGS缺乏統(tǒng)一行業(yè)規(guī)范和檢測標(biāo)準(zhǔn)，導(dǎo)致不同實驗室不同平臺檢測結(jié)果無法比較,。需要對NGS實驗操作部分和生信分析部分建立執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控監(jiān)測事項,。包括建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程、驗證流程,、質(zhì)量管理體系,、數(shù)據(jù)可靠性驗證等,。生物信息分析部分應(yīng)包括：變異結(jié)果描述,、附帶結(jié)果報道、數(shù)據(jù)儲存和版本可追溯性等,。此外,，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)用應(yīng)貫穿在NGS檢測整個流程。

　　三,、NGS技術(shù)臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)分析要點和報告內(nèi)容及格式要求

　　NGS實驗室對變異結(jié)果描述及報告需遵循專業(yè)組織建議與指導(dǎo),。建議遵循人類基因組變異協(xié)會命名指南和美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會遺傳疾病變異分類指導(dǎo)。為避免結(jié)果混淆,，在撰寫臨床結(jié)果報告時,，需要詳細(xì)列出每個變異位點對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本版本號及蛋白編號[12，14],。在描述疑似致病性變異時,，需充分考慮疾病表型、不同人群發(fā)病率,、外顯率及功能學(xué)實驗,，并需要充分利用一些公共數(shù)據(jù)庫。對于一些外顯子組或基因組檢測來說,，評估一個基因?qū)膊∮绊懗潭?，了解不同變異類型對疾病貢獻(xiàn)度及這些變異遺傳模式至關(guān)重要[12，15],。報告內(nèi)容和格式要求可參考中國醫(yī)師協(xié)會檢驗醫(yī)師分會發(fā)布的《臨床基因檢驗診斷報告模式專家共識》,、美國分子病理學(xué)會、美國臨床腫瘤學(xué)會和美國病理學(xué)會專家共識,。以及歐盟NGS診斷指南[17],。NGS檢測報告清晰性和一致性至關(guān)重要,，應(yīng)準(zhǔn)確客觀地描述所檢驗結(jié)果，避免引起歧義,。內(nèi)容總體應(yīng)該明確簡潔并具有充分解釋,。

　　四、我國NGS技術(shù)發(fā)展需要注意的幾個問題

　　當(dāng)前國內(nèi)NGS技術(shù)硬件和國外發(fā)展同步,，但軟件建設(shè)滯后,，硬件建設(shè)可以通過購買迅速完成，軟件建設(shè)需要長時間積累,。軟件建設(shè)包括適合國內(nèi)國情的規(guī)范的檢測指南,，合理有效的監(jiān)管措施，完善數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)以及符合患者需求的遺傳咨詢體系等,。此外,，為保證臨床和檢測實驗室溝通順暢，需要積極提倡中文人類表型標(biāo)準(zhǔn)用語,。隨著基因測序技術(shù)飛速發(fā)展,，獲取基因數(shù)據(jù)越來越便捷，與之對應(yīng)表型信息采集效率滯后,。由于臨床醫(yī)學(xué)歷史悠久,，疾病命名和分類復(fù)雜多樣;很多疾病存在臨床變異性，不同醫(yī)師對于患者描述也存在差異,。模糊表型信息與基因數(shù)據(jù)連接存在障礙,，給基因數(shù)據(jù)解讀帶來困難。

　　五,、展望

　　隨著NGS技術(shù)不斷改進(jìn),，高通量長讀長NGS將是大勢所趨，檢測對象將逐漸從DNA層面向RNA層面轉(zhuǎn)移,。新一代NGS檢測靈敏度,、準(zhǔn)確性和操作便捷性將大大提高。我們有理由相信隨著檢測費(fèi)用持續(xù)下降,、測序方法優(yōu)化升級,、數(shù)據(jù)解讀能力智能化以及臨床經(jīng)驗不斷積累，人員培訓(xùn),、數(shù)據(jù)處理,、質(zhì)量控制、倫理等問題都將迎刃而解,，NGS技術(shù)將會逐漸成為臨床主要且常規(guī)的檢測項目,。