文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A
文章編號： 0258-7998(2014)06-0070-04
癌細(xì)胞分選儀是對細(xì)胞樣品進(jìn)行癌細(xì)胞檢測,、計(jì)數(shù),、分選以及分析的裝置。現(xiàn)代基于流式細(xì)胞術(shù)的流式細(xì)胞分選儀或分析儀通過激光激發(fā)熒光的方式[1],，檢測細(xì)胞的熒光和散射光來獲取細(xì)胞的參數(shù),，并通過分析參數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)或分選等操作。這種方式具有檢測精度高,、分析速度快、分選率高等優(yōu)點(diǎn),，得到了廣泛的應(yīng)用[2],。
傳統(tǒng)的細(xì)胞分選儀大多是基于石英管和毛細(xì)管等平臺，具有集成度比較低,、耗費(fèi)樣品量大的缺點(diǎn)[3],。新興的微流控芯片通過微機(jī)電技術(shù)(MEMS)，將細(xì)胞處理,、檢測與分選等操作集中在一塊芯片上,，大大提高了集成度，并且耗費(fèi)樣品低,，是一種應(yīng)用前景廣闊的技術(shù)[4],。本文在微流控芯片的平臺上，設(shè)計(jì)了癌細(xì)胞分選儀的硬件系統(tǒng),，完成了癌細(xì)胞熒光檢測電路與用于微流控芯片內(nèi)細(xì)胞分選的高壓脈沖源設(shè)計(jì),，實(shí)現(xiàn)了在微流控芯片上癌細(xì)胞檢測、計(jì)數(shù)以及分選的結(jié)合,。
1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)
整個儀器包括液滴產(chǎn)生系統(tǒng),、微流控平臺與激發(fā)光路、主控電路,、熒光檢測電路,、高壓脈沖源和細(xì)胞分選系統(tǒng)。系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)如圖1所示,。
液滴生成系統(tǒng)通過恒流泵在微流控芯片內(nèi)通過流體聚焦將細(xì)胞包裹在液滴中并且在芯片溝道中快速流動,，激光器(532 nm)發(fā)出的激光經(jīng)過光路聚焦到芯片溝道一個點(diǎn)上，對癌細(xì)胞進(jìn)行熒光激發(fā),。
使用北京濱松公司生產(chǎn)的電流輸出側(cè)窗型光電倍增管(PMT)進(jìn)行熒光檢測[5],，將光信號轉(zhuǎn)換為微弱負(fù)電流信號，然后通過熒光檢測電路的放大,、濾波,、A/D轉(zhuǎn)換傳送到主控電路,，主控電路對信號進(jìn)行分析并判斷是否讓高壓系統(tǒng)產(chǎn)生高壓脈沖進(jìn)行細(xì)胞分選。
系統(tǒng)主控電路采用Atmel公司的Atmega128芯片作為主控芯片,，完成與PC通信,、采集與處理熒光數(shù)據(jù)、高壓分選系統(tǒng)等功能,。
微流控平臺示意圖如圖2所示,。整個微流控芯片包括進(jìn)樣口、液滴產(chǎn)生溝道(圖中未畫出),、主溝道,、正負(fù)電極、分選溝道等部分,。電極做在溝道兩側(cè)并與溝道處于同一高度,，以產(chǎn)生垂直于溝道的均勻電場。
圖2微流控芯片示意圖
2 熒光檢測電路設(shè)計(jì)
熒光檢測電路用于檢測PMT輸出的微弱負(fù)電流信號,。癌細(xì)胞產(chǎn)生的熒光信號比較微弱,，PMT輸出的負(fù)電流范圍為數(shù)百皮安~數(shù)微安。這要求前置放大電路具有低噪聲,、高精度的特性[6],。整個熒光檢測電路包括前置變阻放大、濾波電路,、DAC電路,。
前置放大電路采用變阻放大的電路結(jié)構(gòu)，如圖3所示,。電路的直流增益倍數(shù)取決于反饋電阻R2,，根據(jù)Vout=Iin·R2可以計(jì)算前置電路輸出電壓。由相關(guān)文獻(xiàn)可知[7],，采用一級放大可以獲得最高的信噪比,。為了避免輸入屏蔽電纜的寄生電容[8]引起電路振蕩，在電路設(shè)計(jì)中加入電容C1,用以補(bǔ)償信號的相位,。反饋電阻R2并聯(lián)合適的反饋電容C2,，限制信號的帶寬。R3和C3在信號回路中形成一個低通濾波器,，抑制由于背景光引起的噪聲和電阻R2的熱噪聲,，同時(shí)避免了產(chǎn)生很大的負(fù)載效應(yīng)[9]。
圖3 前置放大電路
由于要檢測微弱的負(fù)電流信號,，所以對于運(yùn)算放大器U1有較高的要求,。運(yùn)放應(yīng)當(dāng)具備極小的輸入偏置電流、噪聲低和較大帶寬增益積的特性,。綜合以上考慮,，設(shè)計(jì)中選擇了美國Linear公司的CMOS輸入型精密運(yùn)放LTC6240HV,，該運(yùn)放的性能參數(shù)有：(1)0.1 Hz~10 Hz噪聲為550 n Vp-p；(2)輸入偏置電流IB：典型為0.2 pA,，最大為1 pA,；(3)帶寬增益積：18 MHz。在實(shí)際的電路測試中,，該運(yùn)放對弱電路的檢測能力滿足系統(tǒng)對檢測精度的要求,。
3 可調(diào)高壓脈沖源設(shè)計(jì)
設(shè)計(jì)的高壓脈沖源用于產(chǎn)生0~1 200 V范圍的可變寬度的脈沖信號，形成垂直電場加在微流控芯片的溝道兩側(cè),，以分選檢測到的癌細(xì)胞液滴,。分選時(shí)通過調(diào)節(jié)脈沖的寬度和高度來達(dá)到最優(yōu)的分選效果。
可調(diào)高壓脈沖發(fā)生器的結(jié)構(gòu)如圖4所示,，整個電路包括了可調(diào)直流高壓模塊,，DAC高壓調(diào)節(jié)電路、IGBT以及IGBT驅(qū)動電路等部分,。電路采用兩個IGBT組成半橋結(jié)構(gòu)，采用懸浮驅(qū)動技術(shù)[10],，避免了采用單個IGBT時(shí)由于負(fù)載太輕而導(dǎo)致關(guān)斷時(shí)放電太慢,，形成下降沿不夠陡峭的問題。通過單片機(jī)的控制信號控制IGBT驅(qū)動器,，從而控制上下兩個IGBT的導(dǎo)通與關(guān)斷,，形成脈沖寬度可調(diào)的脈沖信號。單片機(jī)控制DAC輸出不同電平的高壓調(diào)節(jié)信號控制高壓模塊,，來獲得0~1 200 V范圍內(nèi)的脈沖峰值,。系統(tǒng)中采用的直流高壓模塊為恒博可調(diào)高壓，輸出電壓為0~1 200 V,，IGBT為FGA25N120ANTD,，耐壓值為1 200 V, IGBT驅(qū)動器采用exb841模塊。
圖4 可調(diào)高壓脈沖源結(jié)構(gòu)框圖
在電路測試中發(fā)現(xiàn),，IGBT切換產(chǎn)生脈沖時(shí),會產(chǎn)生比較大的電壓尖峰,，當(dāng)設(shè)置的電壓較高時(shí)，產(chǎn)生的電壓尖峰很可能會對電路元件產(chǎn)生損壞,，因此在電路中加入了尖峰吸收與緩沖電路,，如圖5所示。
圖5 尖峰吸收與緩沖電路
電路中D2與D3構(gòu)成雙向限幅電路,，將驅(qū)動電壓限制在-5 V~+15 V,，R5與C8組成RC電路設(shè)定脈沖上升與下降時(shí)間，以消除電壓尖峰,，RC時(shí)間常數(shù)越大,，消除尖峰效果越好,，但同時(shí)脈沖上升與下降時(shí)間變長，測試中發(fā)現(xiàn)R5取10 Ω,，C8取20 pF時(shí),，可以獲得比較良好的消峰與脈沖邊沿特性。D1與C7用于保護(hù)exb841內(nèi)部的穩(wěn)壓管,。
4 系統(tǒng)測試
4.1熒光檢測電路測量精度測試
直流信號下,，檢測電路輸出的結(jié)果與五位半萬用表測量結(jié)果相比，偏差小于50 μV,。
在電路懸空輸入(輸入電流為零)情況下測試電路噪聲與分辨力,，當(dāng)采樣率為10 Hz時(shí)，得到的輸出噪聲曲線如圖6所示,?？梢钥吹皆诖瞬蓸勇氏码娐繁旧碓肼昖p-p小于5 μV，根據(jù)反饋電阻為100 kΩ,，等效輸入電流噪聲為50 pA,，可認(rèn)為電路具有100 pA量級的輸入電流信號分辨能力，滿足系統(tǒng)的測量要求,。采樣率上升時(shí),，ADC引起的噪聲會有所增加。
圖6 電路噪聲測試
采用檢測電路檢測濃度為8×104/mL的乳腺癌細(xì)胞熒光曲線如圖7所示,。細(xì)胞懸浮液中的雜質(zhì)會引起一些較低的峰,，使用無癌細(xì)胞的懸浮液進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，雜質(zhì)引起的峰一般小于400 mV,，可以通過設(shè)定這個電壓作為閾值來判斷檢測到的峰是否是細(xì)胞引起的,。從圖中可以看到，5 s內(nèi)檢測到了6個癌細(xì)胞,。
圖7 癌細(xì)胞熒光檢測結(jié)果
4.2 高壓脈沖信號源測試
經(jīng)過單片機(jī)軟件的線性偏差修正后,，高壓脈沖的峰值與預(yù)設(shè)值之間偏差小于1 V，具有較高的精度,，滿足系統(tǒng)的要求,。
脈沖的上升時(shí)間和下降時(shí)間可以通過IGBT的基極串聯(lián)電阻來調(diào)節(jié),以取得脈沖過沖尖峰大小和上升、下降時(shí)間大小的平衡,在本設(shè)計(jì)中取基極串聯(lián)電阻為10 ?贅,，得到的1 200 V左右時(shí)脈沖上升下降波形如圖8所示,。可以看到脈沖上升,、下降時(shí)間都約為10 μs,，脈沖源最高可以產(chǎn)生頻率為20 kHz的高壓脈沖信號。
圖8 高壓脈沖的上升,、下降沿測試圖
4.3 細(xì)胞分選的測試
用羅丹明液滴模擬帶有癌細(xì)胞的液滴進(jìn)行細(xì)胞分選,。當(dāng)檢測到超過閾值的熒光脈沖時(shí),，系統(tǒng)經(jīng)過一定時(shí)間后產(chǎn)生一個脈沖分選出對應(yīng)的液滴。圖9是在顯微鏡下觀察到的一組結(jié)果,。
從圖9中可以看到,在電極上加上600 V,、50 ms脈寬的高壓脈沖后，待分選的液滴發(fā)生偏離,，而其余的液滴不受影響,最后成功將待分選液滴分選到左側(cè)的溝道當(dāng)中,。
圖9 高壓脈沖分選細(xì)胞測試圖
設(shè)計(jì)的基于微流控芯片的流式細(xì)胞分選系統(tǒng)采用AVR單片機(jī)為核心處理器，完成了微弱細(xì)胞熒光的檢測電路的設(shè)計(jì),、細(xì)胞分選高壓脈沖電路以及控制電路設(shè)計(jì),，在單片微流控芯片上實(shí)現(xiàn)了癌細(xì)胞的檢測、計(jì)數(shù)以及分選,。系統(tǒng)的硬件部分已經(jīng)初步完成,，經(jīng)過測試，硬件各方面的參數(shù)均能滿足系統(tǒng)的要求,，為后期系統(tǒng)的整合和優(yōu)化打下了比較好的基礎(chǔ),。
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