壹 液體活檢背景介紹

　　近年來(lái),，腫瘤診療技術(shù)已取得很大進(jìn)步,，但是癌癥依然是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的主要因素。癌癥轉(zhuǎn)移是造成癌癥患者死亡的重要因素,，同時(shí)轉(zhuǎn)移過(guò)程相對(duì)復(fù)雜,，增加了癌癥診療的困難。因此,，對(duì)于癌癥,，做到早期診斷,、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和準(zhǔn)確預(yù)后是非常關(guān)鍵的。

　　目前,，傳統(tǒng)的組織活檢方式存在很多問(wèn)題,，如：成本高、取樣難,、創(chuàng)傷大等,，且難以做到“早篩查、早治療”,。隨著生物技術(shù),、分子技術(shù)和納米技術(shù)的發(fā)展，一系列新型技術(shù)被應(yīng)用到癌癥的診療中,。液體活檢作為體外診斷的前沿領(lǐng)域,，涵蓋非侵入式取樣，檢測(cè)腫瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放到血液中的循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物(CTCs,、Exosomes和cNAs),，為監(jiān)測(cè)腫瘤動(dòng)態(tài)及個(gè)體化治療提供新的方式，受到人們的關(guān)注(圖1),。

　　圖1：癌癥的形成(A),、轉(zhuǎn)移(B)及循環(huán)腫瘤標(biāo)志物的特點(diǎn)(C)

　　貳 微流控技術(shù)的應(yīng)用分析液體活檢背景介紹

　　1 微流控技術(shù)概述

　　微流控技術(shù)是一種在微米尺寸級(jí)別下處理或操縱液體的技術(shù)手段，將混合器,、執(zhí)行器,、反應(yīng)器、分離器,、傳感器等集于一體,，從而優(yōu)化檢測(cè)過(guò)程。其涉及到電子,、機(jī)械,、化學(xué)、物理和生物等多門(mén)學(xué)科,，具有通量高,、靈敏度高、樣本分析時(shí)間短,、樣本量少,、可控性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代分析化學(xué),、藥劑學(xué),、細(xì)胞生物學(xué)、遺傳學(xué)等諸多研究領(lǐng)域。也正是基于以上多種優(yōu)勢(shì),，微流控技術(shù)為探索液體活檢中的循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物檢測(cè)打開(kāi)通道,，為癌癥的早期診斷與治療提供新的有效手段。

　　2 應(yīng)用分類(lèi)介紹

　　1) 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)檢測(cè)

　　循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指從原發(fā)腫瘤或者轉(zhuǎn)移灶的邊緣脫落進(jìn)入癌癥患者外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞,，其不僅攜帶了腫瘤細(xì)胞的全部基因組并且在癌癥病變?cè)缙诰鸵呀?jīng)存在于外周血循環(huán)中,，因此CTCs被作為癌癥研究的重要對(duì)象和癌癥早期診斷、療效評(píng)估的重要標(biāo)志物,，可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)非侵入式的監(jiān)控癌癥的發(fā)展變化及治療效果,。

　　近年來(lái)，CTCs的分離與純化技術(shù)不斷發(fā)展,，但由于CTCs的腫瘤異質(zhì)性及稀有性(每107-109個(gè)血液細(xì)胞中僅有1-10個(gè)CTCs),，分離與純化CTCs面臨巨大挑戰(zhàn)。微流控技術(shù)平臺(tái)因其集成度高,、設(shè)計(jì)靈活,、材料通用性強(qiáng)和自動(dòng)化程度高，被廣泛應(yīng)用于CTCs的分離純化中,。

　　目前,，基于微流控技術(shù)分離CTCs的方法大致分為兩大類(lèi)：無(wú)標(biāo)簽技術(shù)和免疫親和技術(shù)(圖2)。前者是建立在物理性質(zhì)基礎(chǔ)上分離目標(biāo)細(xì)胞,，如大小,，密度，形狀,，變形性和介電性能,，而后者主要利用靶細(xì)胞的生化特性，通過(guò)細(xì)胞表面特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物(主要分為anti-EpCAM正向捕獲法與anti-CD45負(fù)向富集法)分離靶細(xì)胞(圖2),。

　　圖2：微流控系統(tǒng)分離CTCs的方法

　　基于免疫磁珠分離富集CTCs是最常用的方法,，具有高靈敏度和高特異性。美晶醫(yī)療自主研發(fā)的基于微流控技術(shù)的CTCs檢測(cè)平臺(tái)CellRichTM,，可以通過(guò)癌細(xì)胞表面抗原和共軛偶聯(lián)到磁珠上的抗體間的相互作用,，高效富集CTCs。當(dāng)血液流經(jīng)該微流體裝置時(shí),，其他血細(xì)胞在流體力學(xué)的作用下被分離出去，與免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞會(huì)在磁場(chǎng)的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn)進(jìn)入分離富集通道,，以此達(dá)到對(duì)循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離捕獲的目的,。此法與傳統(tǒng)的物理分離方法相比，具有較高的回收率與純化度(圖3),。

　　圖3：基于免疫磁珠分離CTCs的微流控系統(tǒng)

　　2) 外泌體檢測(cè)

　　循環(huán)腫瘤外泌體是指由腫瘤細(xì)胞分泌的具有生物活性的囊泡小體,，直徑為20-300nm。不同來(lái)源的外泌體含有其獨(dú)特的脂質(zhì),、RNA,、DNA和蛋白質(zhì)等,，可直接反映細(xì)胞的來(lái)源及進(jìn)展。外泌體廣泛存在于人體體液中,，具有很高的豐度(每毫升血液中含有109-1012個(gè)外泌體),。因此對(duì)腫瘤來(lái)源外泌體的檢測(cè)和分析可以作為無(wú)創(chuàng)探究腫瘤來(lái)源與進(jìn)展，進(jìn)而輔助腫瘤的早期診斷和指導(dǎo)腫瘤治療,。

　　近年來(lái),，外泌體作為腫瘤生物標(biāo)志物成為無(wú)創(chuàng)活檢(液體活檢)的研究熱點(diǎn)，但外泌體分泌是一種動(dòng)態(tài)的過(guò)程,，其在體液中實(shí)時(shí)變化,，且在腫瘤治療過(guò)程中也存在穩(wěn)定性問(wèn)題。因此,，精確分離和分析外泌體仍然面臨巨大挑戰(zhàn)性,。與傳統(tǒng)的外泌體分離技術(shù)如超速離心法，密度梯度離心法等相比,，微流控技術(shù)在檢測(cè)自動(dòng)化,、集成能力、消耗時(shí)間,、產(chǎn)物完整性,、純度、回收率等方面具有很大優(yōu)勢(shì),，進(jìn)而有利于外泌體的下游分析應(yīng)用,。

　　目前，基于微流控技術(shù)分離純化外泌體的方法主要分為兩大類(lèi)：囊泡大小(20-300nm)和表面生物標(biāo)志物(如EpCAM,、CD9,、CD63、CD81),，且各有特點(diǎn),。前者建立在納米多孔結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)快速高效捕獲外泌體,，但因外泌體的尺寸范圍在納米級(jí)別,，因此對(duì)技術(shù)要求較高，且可能受到飽和限制;后者利用免疫親和原理,，建立的微流控系統(tǒng)有抗體修飾微通道或免疫磁珠法(圖4),，具有高通量、高靈敏度,，然而外泌體也具有與CTCs類(lèi)似的異質(zhì)性,，對(duì)于特定生物標(biāo)志物低表達(dá)的外泌體捕獲效率不高。

　　圖4：基于免疫親和原理分析外泌體的微流控系統(tǒng)

　　另外，對(duì)于外泌體的研究雖發(fā)展迅速,，但與CTCs相比,，市場(chǎng)上缺乏成熟的微流控檢測(cè)系統(tǒng)，在液體活檢領(lǐng)域,，外泌體的研究應(yīng)用沒(méi)有CTCs廣泛和成熟,。因此，為了更精準(zhǔn)的定量和定性分析腫瘤來(lái)源外泌體,，深入探究外泌體的物理與生物特性,，設(shè)計(jì)結(jié)合多個(gè)功能于一體的新型微流控系統(tǒng)，對(duì)于分離分析外泌體是至關(guān)重要的,。

　　3) cNAs檢測(cè)

　　循環(huán)核酸(cNAs)是指血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的DNA和RNA片段,。可以通過(guò)非侵入性手段獲取cNAs,，用于分析腫瘤的遺傳信息及表觀遺傳信息,。基因表達(dá)譜與腫瘤的發(fā)展及進(jìn)展顯著相關(guān),。因此,，cNAs作為液體活檢重要的生物標(biāo)志物，可用于癌癥的早期診斷和療效評(píng)估,。

　　鑒于現(xiàn)在檢測(cè)技術(shù)不成熟,，限制了腫瘤標(biāo)志物cNAs的臨床應(yīng)用。傳統(tǒng)提取分析核酸的方法,，如電泳結(jié)合熒光染色技術(shù),，有一定的局限性，勞動(dòng)密集型和高成本,，且分步操作容易導(dǎo)致樣品損失,。微流控系統(tǒng)集多種技術(shù)于一體，一個(gè)設(shè)備可順序執(zhí)行多個(gè)操作,，如樣品制備,，反應(yīng)，分離,，純化和分析,，減少樣本損失，提高樣本純度,。

　　因此,，新型微流控系統(tǒng)可作為科研人員研究循環(huán)生物標(biāo)志物的重要手段，亦是檢測(cè)腫瘤生物標(biāo)志物的未來(lái)發(fā)展方向,。但是,，目前用于cNAs檢測(cè)的微流控系統(tǒng)，依然存在待解決的難題：a)常規(guī)提取核酸的過(guò)程是分步完成的,，不能保證核酸片段的完整性,，易導(dǎo)致分析錯(cuò)誤，需要開(kāi)發(fā)柔和,、簡(jiǎn)便,、快捷的提取核酸方法，從而充分發(fā)揮基因圖譜分析及分子測(cè)序技術(shù)的強(qiáng)大功能,。b)傳統(tǒng)的微流控系統(tǒng)只是單純的分離系統(tǒng),， cNAs分析，需借助qPCR,，數(shù)字PCR和測(cè)序平臺(tái)等,，而PCR方法有其內(nèi)在的限制，如擴(kuò)增錯(cuò)誤,，重復(fù)性差和擴(kuò)增效率不同,。

　　圖5：分析cNAs的微流控系統(tǒng)

　　另外，遺傳突變?cè)诓煌[瘤中的概況遠(yuǎn)比我們所能想象的要復(fù)雜,，存在嚴(yán)重的腫瘤異質(zhì)性,，使得通過(guò)解析cNAs輔助癌癥診療更加艱難。這要求優(yōu)化現(xiàn)有微流控系統(tǒng)性能,，結(jié)合基因特性,，開(kāi)發(fā)更多高精準(zhǔn)、高效率,、高集成度的微流控系統(tǒng),，從而更好地服務(wù)于液體活檢的臨床應(yīng)用。

　　叁 結(jié)語(yǔ)

　　液體活檢作為一種新型的非侵入性的樣本獲取方法,，為癌癥診斷與治療提供新的方式,。微流控技術(shù)因其具有高度集成化及時(shí)空操控性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，為液體活檢提供重要平臺(tái),，并吸引了科學(xué)界和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)界的極大關(guān)注,。

　　與此同時(shí)，在臨床腫瘤診療的轉(zhuǎn)化應(yīng)用上,，腫瘤液體活檢依然面臨重重挑戰(zhàn)：

　　a)這三種腫瘤生物標(biāo)志物的含量及其稀少,，且存在腫瘤異質(zhì)性，使得對(duì)其分離和純化非常困難,?？朔@一挑戰(zhàn)，需要開(kāi)發(fā)充分利用腫瘤生物標(biāo)志物的物理學(xué)與生物學(xué)特性相結(jié)合的微流控平臺(tái),。

　　b)高精準(zhǔn)度,、全自動(dòng)化的基于微流控分離,、純化腫瘤生物標(biāo)志物的系統(tǒng)多處于科研階段，未被臨床廣泛應(yīng)用,。

　　c)循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物與微流控平臺(tái)之前的關(guān)系尚需完善,，為進(jìn)一步推動(dòng)靈敏度高、重復(fù)性好的微流控系統(tǒng)的開(kāi)發(fā),，需在多種癌癥患者中進(jìn)行大量的臨床試驗(yàn),。

　　d)我們對(duì)腫瘤生物學(xué)的理解仍處于起步階段。隨著不斷深入研究各種循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物在腫瘤形成和發(fā)展中的作用,，更強(qiáng)大,、更有效的商業(yè)化微流控系統(tǒng)將應(yīng)運(yùn)而生。

　　相信,，未來(lái),，在腫瘤液體活檢及個(gè)體化診療領(lǐng)域，微流控技術(shù)將會(huì)發(fā)揮越來(lái)越重要的作用,。