光纖是現(xiàn)代醫(yī)學臨床應(yīng)用中的重要工具,，可以在最小侵入程度的條件下進入狹小空間,，向特定區(qū)域傳輸激發(fā)光并收集光信號，實現(xiàn)顯微成像,；同時,，光纖探針也可直接用作外科手術(shù)工具,。將非線性光學成像與光纖傳輸相結(jié)合可以實現(xiàn)更加高效的內(nèi)窺成像。本期介紹兩個基于梯度折射率多模光纖的非線性光學內(nèi)窺鏡系統(tǒng),。

第一個系統(tǒng)將雙光子（TPEF）成像系統(tǒng)與飛秒激光消融手術(shù)（FLA）集成于同一個光纖探針,。如圖1所示，中心波長在1030nm的光纖激光在PBS處分為照明光束和參考光束,。照明光束部分放置了空間光調(diào)制器（SLM）,，并將調(diào)制平面成像到光纖的輸入端。光纖另一端利用透鏡對將光纖的輸出成像到CMOS的探測陣列上,。調(diào)節(jié)不同波前輸入并記錄輸出，計算出傳輸矩陣（TM），就可以在遠端用SLM控制輸出光斑,。剩余的光路部分用于研究聚焦后光束的性質(zhì),，檢驗是否勝任FLA手術(shù)脈沖傳輸。脈寬通過雙光子干涉自相關(guān)儀來測量,，光路中放置翻折鏡,，用來切換操作區(qū)域的明場成像。雙光子熒光信號收集利用雙色鏡同步進行,，通過透鏡聚焦到PMT,，成像結(jié)果用于引導手術(shù)操作。

利用上述系統(tǒng)測試了兩種梯度折射率（GRIN）光纖,，芯徑分別是200um和400um,。實驗測量了三種不同脈寬下的聚焦效率以及焦點處峰值強度隨輸入能量的變化，兩種光纖的最大聚焦效率都在28％左右,，考慮到測量條件限制,，已經(jīng)接近最優(yōu)狀態(tài)。

系統(tǒng)中遠端的聚焦則基于測量傳輸矩陣,，但是當脈沖能量超過臨界值時,，會產(chǎn)生非線性效應(yīng)，使得通過傳輸矩陣實現(xiàn)的光束掃描質(zhì)量下降,。為減少非線性積累,，作者在后續(xù)成像中選用了長度為10cm、芯徑為400um的GRIN光纖,，焦點尺寸為2．3 μm,，視場大于200 μm。

此外,，全系統(tǒng)無透鏡聚焦,、無機械掃描，探頭尺寸在200 ～ 400 μm,。隨后作者對小鼠耳蝸樣本進行了FLA與TPF的成像實驗,。圖2為染色后的小鼠耳蝸毛細胞的雙光子成像結(jié)果，b為黃框部分放大圖,，c為選擇性消融掉了一個細胞后的對比圖,，消融可以發(fā)生在7×7um2的區(qū)域，而不影響相鄰細胞的熒光信號,。

第二個系統(tǒng)是基于GRIN光纖的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）顯微鏡,。CARS在組織形態(tài)成像的基礎(chǔ)上還增加了化學對比成像，特別適合于區(qū)分細胞中脂肪,、蛋白質(zhì)等成分,。

如圖3所示,，光源采用波長在830－820nm的藍寶石激光器，一部分用來泵浦OPO,，產(chǎn)生661－668nm的泵浦光,，另一部分作為斯托克斯光。經(jīng)由延時裝置和雙色鏡使兩束光時空重合,，后經(jīng)一組消色差透鏡擴束進入SLM,。波前控制的光路與前一系統(tǒng)一致，但增加了D形鏡及偏振控制單元來完全控制輸入光的偏振,，對傳輸矩陣求解更完備,，可提高激發(fā)光的利用率。

光路中利用LED和相機獲得明場成像以便定位樣品,。樣品產(chǎn)生的CARS信號既可以前向收集,，也可以背向收集。所用GRIN光纖的芯徑為50um,，包層為125um,，NA為0．29，長度控制在30－35mm,。在泵浦波長和斯托克斯波長下,，纖芯中心附近形成的光斑的半高寬分別為1．23和1．55 um。

2umPS珠子團簇正向及背向CARS成像的結(jié)果,，前向傳輸信號比背向強50倍,，但背向收集信號依然可以成像并定位2um珠子位置信息。圖（d－g）顯示了在兩種物質(zhì)的峰值頻移處分別測量的結(jié)果,，組合圖在同一幅圖中獲得了兩種珠子的位置信息,。

總之，本期介紹了兩個基于GRIN多模光纖的非線性光學內(nèi)窺鏡系統(tǒng),，均采用波前調(diào)制來完成無光學及機械元件的遠端掃描及聚焦,，最終實現(xiàn)了生物樣本中的高分辨內(nèi)窺成像，對搭建應(yīng)用于生醫(yī)方向的多光子小型化顯微鏡具有借鑒意義,。

參考文獻：

［1］ Kakkava,， Eirini， et al． ＂Selective femtosecond laser ablation via two－photon fluorescence imaging through a multimode fiber．＂ Biomedical optics express 10．2 （2019）： 423－433．

［2］ Tr?g?rdh,， Johanna,， et al． ＂Label－free CARS microscopy through a multimode fiber endoscope．＂ Optics express 27．21 （2019）： 30055－30066．

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