0 引言

　　目前,，食品安全問題日益突出，如何快速檢測食品中微生物是否達標是國內外食品微生物檢測人員共同關注的焦點,。傳統(tǒng)的食品衛(wèi)生達標檢測方法采用基于細菌培養(yǎng)的平皿法,，該方法及結果得到各種標準的認可,，但是這種細菌培養(yǎng)的方法具有一定的局限性，如：不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法只適合檢測特定的微生物,，如霉菌,、厭氧菌、藻類等均有特定的檢測方法,，此外培養(yǎng)法影響結果的人為因素較多,，操作周期長達1~5天。簡而言之,，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測微生物存在檢測效率較低,、驗證周期長、培養(yǎng)條件多樣,、難以多種菌類品種同時檢測等諸多限制,，難以適應衛(wèi)生檢驗機構對食品中微生物快速檢測的需求。

　　本文主要闡述一種基于ATP生物發(fā)光原理測定微生物含量的方法(即ATP檢測技術[1]),，介紹了該系統(tǒng)的軟,、硬件平臺的設計原理，通過采用生化反應,、傳感器和電子系統(tǒng)相結合的方法,，實現(xiàn)對溶液中細菌數(shù)量的檢測，最后給出了詳細的測試數(shù)據(jù)和分析結果,。

　　該微生物檢測儀具有檢測周期短,、操作簡易等優(yōu)點，可在許多領域替代傳統(tǒng)測試方法,，從而大大提高效率,，為食品安全提供堅實的保障。

　　1 系統(tǒng)硬件設計與實現(xiàn)

　　系統(tǒng)硬件框圖如圖1所示,。系統(tǒng)從信號采集模塊得到源信號,，經(jīng)過微控制器模塊的處理和控制后，最終將結果在觸摸屏上顯示并存儲,。

　　微控制器模塊采用了STM32F407,。光電倍增管、電壓放大器,、電壓比較器構成了信號采樣模塊,。高壓模塊為光敏器件提供高壓電源。電機模塊主要為黑暗測試環(huán)境提供一道門禁,，并用光電傳感器監(jiān)測門禁是否正常開關,，形成反饋機制。用戶界面選取觸屏的交互方式,，方便用戶操作和界面定制,。存儲模塊由microSD卡上搭建文件系統(tǒng)，供PC機查看存儲的歷史記錄,。

　　1.1 電源模塊

　　系統(tǒng)采用7組電源供電,，如圖2所示。

　　當無外接電源時,，由內置12 V蓄電池供電,，接入外部電源后,將對蓄電池進行充電；待蓄電池充滿電后,將借助二極管斷開蓄電池的對外供電通路,，以延長蓄電池壽命,。

　　1.2 微控制器模塊

　　本系統(tǒng)采用意法半導體的STM32F407微處理器。該微處理器為32 bit,、ARM cortex-M4核,、主頻可達168 MHz，提供210 DMIPS的運算能力,，具有1MB的可編程閃存（Flash）和192 KB的SRAM,。系統(tǒng)使用到的MCU外設功能包括：

　　TIMER輸入捕獲采樣脈沖信號；DAC調節(jié)輸出電壓,，ADC監(jiān)控高壓模塊輸出電壓反饋,；TIMER PWM輸出控制電機模塊；FSMC總線輸出數(shù)據(jù)到顯示屏,，SPI總線接收觸摸輸入信號,；SDIO總線與microSD卡通信，讀寫歷史記錄和配置參數(shù),；USB與PC機進行MassStorage類通信,。

　　1.3 信號采樣模塊

　　信號采樣模塊采用光電倍增管采集微生物發(fā)光強度，并轉化為微弱電脈沖信號,。該電脈沖信號是整個系統(tǒng)的信號源頭,，后續(xù)的信號處理、顯示以及存儲都針對該核心信號源進行運算分析,。因此光電傳感器的選擇,、放大整形電路的設計以及信號捕獲方式的選擇是系統(tǒng)硬件設計中的重中之重。

　　1.3.1 光電倍增管

　　由于微生物發(fā)光微弱,、短暫,、穩(wěn)定性差、發(fā)光曲線呈類拋物線型且信號易被淹沒,，故本設計采用端窗式光電倍增管,，它具有高信噪比、高靈敏度和高穩(wěn)定性特點,，可最大程度地滿足對微生物采光的需求,。

　　光電倍增管內部構造示意圖如圖3所示,，光電倍增管的光電陰極和陽極之間還放置多個瓦形倍增電極，使用時相鄰兩倍增電極間均加高壓,。光電陰極受光照后釋放出光電子,，在電場作用下射向第一倍增電極，引起電子的二次發(fā)射,，激發(fā)出更多的電子,，然后在電場作用下飛向下一個倍增電極，再次激發(fā)出更多的電子,。如此電子數(shù)不斷倍增,，陽極最后收集到的電子可增加 104～108倍，這使光電倍增管的靈敏度比普通光電管要高得多,，可用來檢測微弱光信號[2],。

　　生物發(fā)光的亮度范圍是10-17～10-7 mol/cell，波長為300 nm～600 nm之間,，系統(tǒng)需要的光電倍增管必須對照此范圍來確定型號,。圖4給出了所選用的光電倍增管光譜響應特性曲線，從中可以看出光電倍增管轉換效率(陰極靈敏度)隨入射光波長的變化改變[4],，其波長測量范圍包含300 nm～600 nm區(qū)間,，且在420 nm處靈敏度最高，適合本系統(tǒng)需求,。

　　該光電倍增管屬于脈沖型倍增管,，它適用于光強不大的場合，可將采集到的微弱光信號轉化為微弱電脈沖信號,。由于微生物發(fā)光強度非常低,，在0～106個光子級別，所以倍增管的輸出電壓大小為微伏到毫伏級別,，需要外部電路進行放大,。

　　外部處理采用CC228P作為光電管的高壓電源，光電倍增管輸出微弱的電脈沖信號,，經(jīng)過AD603構成的電壓放大器放大,，以及電壓比較器整形，電路最終輸出了幅度在0～3.3 V之間的標準脈沖,。

　　電路輸出的標準脈沖的寬度為2.5 ns,，頻率隨脈沖數(shù)的大小而變化，最大頻率范圍約為10 MHz,。ATP濃度不同時,，光電倍增管輸出脈沖示意圖如圖5所示。

　　1.3.2 MCU定時器輸入捕獲

　　由于光電倍增管產生的電脈沖在1 Hz～12.5 MHz,，頻率較高,，故采用STM32定時器的輸入捕獲計數(shù)法,。軟件配置好定時器捕獲模式后，定時器便進入硬件工作,，從而有效提高處理器的工作效率,。

　　信號采樣模塊使用了輸入捕獲模式以測量脈沖頻率,。當檢測到TIM1_CH1上出現(xiàn)下降沿時,，計數(shù)器當前值TIM1_

　　CNT加1，存入捕獲比較寄存器TIM1_CCR1中,，完成一次捕獲,。當達到設定閾值(65535溢出)，則發(fā)生捕獲中斷,，進入中斷處理函數(shù),，自定義的整形couter自增1。TIM2每1 s進一次中斷,，讀取TIM1中的couter和TIM1_CNT,，則這1 s的脈沖數(shù)為：conter65535+TIM1_CNT。

2 系統(tǒng)軟件設計與實現(xiàn)

　　微生物檢測系統(tǒng)軟件部分的設計與實現(xiàn),，涉及功能實現(xiàn)和交互設計兩大任務,。鑒于本系統(tǒng)功能需求較為復雜，觸摸界面與控件繁多,，需要存儲用戶配置和歷史記錄,，并在PC機上以文件形式讀寫，本系統(tǒng)選擇采用μC/OS-II+μC/GUI+FatFS+USB的軟件結構作為中間件,，其通用的上下層接口,，便于編寫規(guī)范的程序以及后續(xù)升級。本章主要圍繞中間件移植和應用層實現(xiàn)兩方面展開詳細介紹,。

　　2.1 中間層詳細介紹

　　系統(tǒng)軟件架構設計的目標從微觀上講,，需要實現(xiàn)控件對應功能，以及界面的狀態(tài)切換,?；谏鲜鲆螅到y(tǒng)軟件圍繞軟件結構大致可分為三層：底層硬件驅動程序,，中間層OS,、GUI、文件系統(tǒng)以及上層應用層用戶程序,。

　　本系統(tǒng)中間層包括μC/OS-II,、μC/GUI、FatFS和USB協(xié)議,，下面介紹上述模塊的移植以及應用層調用接口,。

　　2.1.1 μC/OS-II移植

　　μC/OS-II是一個廣泛應用于微控制器的實時操作系統(tǒng)內核,，它包含了任務調度、任務管理,、事件管理,、內存管理和任務間的通信與同步等基本功能，但是沒有提供輸入/輸出管理,、文件系統(tǒng),、網(wǎng)絡等額外的服務[5]，所以本系統(tǒng)圖形用戶界面和文件系統(tǒng)都需要單獨移植,。

　?。?）μC/OS-II軟件體系結構

　　μC/OS-II軟件架構主要包括以下5大模塊：應用程序、μC/OS-II內核代碼,、μC/OS-II與硬件相關的代碼,、BSP層、Cortex-M4內核,。其中需要自行編寫的主要是應用程序,，移植時需要修改與硬件相關的代碼，其余部分基本可以沿用μC/OS-II的開源代碼,。

　　(2)實時操作系統(tǒng)μC/OS-II內核移植

　　在移植過程中,，需要修改的軟件主要是與處理器相關的3個文件，包括設置庫文件OS_CPU中與處理器和編譯器相關的代碼,，用C語言編寫的6個與操作系統(tǒng)相關的函數(shù)C文件,，用匯編語言編寫的4個與處理器相關的函數(shù)匯編文件。需改寫OS_CPU.H,、OS_CPU.C,、OS_CPU_

　　A.ASM、startup_stm32f4xx.s,、os_cpu_a.asm.s文件[6],。

　　2.1.2 μC/GUI移植

　　Micrium公司開發(fā)的μC/GUI是一種通用嵌入式應用的圖形界面軟件，它可為任何使用LCD圖形顯示的應用提供一套高效的獨立于處理器及LCD控制器而設計的圖形用戶接口,，適用于單任務或是多任務系統(tǒng)環(huán)境,，通常和μC/OS-II結合使用。

　　本系統(tǒng)采用μC/GUI 3.90a版本,，該版本優(yōu)點是移植時需要改動的地方少,，LCD底層驅動獲取方便，不依賴于μC/GUI官方驅動,。

　　μC/GUI系統(tǒng)移植主要涉及底層驅動配置文件,，為了適用個性化的LCD、LCD控制器以及觸摸屏硬件，主要需要修改LCDConf.h,、GUIConf.h,、LCD底層驅動這3個文件。

　　2.1.3 USB驅動

　　由于USB總線具有通用性,、穩(wěn)定性,、便利性、高傳輸速率等良好特性[7],，系統(tǒng)選擇USB總線協(xié)議實現(xiàn)上下位機通信,。根據(jù)系統(tǒng)需求，選用USB2.0規(guī)范,，運行在全速模式（12 Mb/s）下,，PC機作為主機,，本系統(tǒng)作為設備,。

　　2.2 應用層詳細介紹

　　應用層軟件按系統(tǒng)功能需求分為5大模塊：數(shù)據(jù)采集與處理、參數(shù)設置,、數(shù)據(jù)校正,、人機交互和歷史數(shù)據(jù)查詢。

　　系統(tǒng)上電后首先初始化各硬件模塊,，一切正常之后進入用戶界面,。用戶界面可設置為英文或中文顯示。在主菜單界面中點擊相應控件可進入下一級界面,，包括：基本測試,、測試選擇、測試設定,、測試歷史,。

　　進行測量時，應首先選定序號,，默認為上次操作時選擇的序號,。測量方式可設定為基本測試或平均測試?；緶y試時需要自定義等待時間,、測試時長。平均測試則需要自定義等待時間,、測試時長和平行個數(shù),。

　　在GUI中，使用GUI_WIDGET_CREATE_INFO結構體表示各個界面,，用于存放界面中的控件種類,、數(shù)量、ID，結構體原型如下：

　　struct GUI_WIDGET_CREATE_INFO_struct

　　{

　　GUI_WIDGET_CREATE_FUNC* pfCreateIndirect;

　　const char* pName,；/*控件指針*/

　　I16 Id,；/*ID號，在對話框中唯一標示*/

　　I16 x0,y0,xSize,ySize,；/*定義位置和大小*/

　　U16 Flags,；/*控件的特殊創(chuàng)建標志（可選）*/

　　I32 Para；/*控件的特殊參數(shù)（可選）*/

　　}

　　界面消息回調函數(shù)在發(fā)生事件時將被自動調用,，并根據(jù)發(fā)生事件的ID進入相應分支進行處理：static void _cbCallback_xxx (WM_MESSAGE* pMsg),。

3 測試與總結

　　本系統(tǒng)在研發(fā)過程中進行了大量前中期測試，為系統(tǒng)軟硬件設計和調整提供了大量依據(jù),。以下將展示系統(tǒng)開發(fā)階段的測試結果,，并給出系統(tǒng)功能與性能測試報告。

　　3.1 仿真測試

　　理論上,，供給生物發(fā)光的ATP含量范圍為0～10-8 mol,，對應的RLU脈沖頻率范圍是0～8 MHz。在后端數(shù)字系統(tǒng)的開發(fā)階段,，可以借助頻率發(fā)生器產生電脈沖信號來模擬RLU,，用以測試后端系統(tǒng)對不同頻率脈沖的處理能力，且該頻率精確穩(wěn)定,，可以消除外部因素的干擾[3],。表1列出了測試結果，數(shù)據(jù)表明STM32F407的定時器模塊可以檢測到0 Hz～12.5 MHz的矩形脈沖,，超出12.5 MHz后,，計數(shù)值達到瓶頸，無法繼續(xù)往上計數(shù),。由于實物RLU值主要范圍在0～8 MHz,，而且對于超出范圍的樣液，可以通過稀釋的辦法使其ATP的值下降到計數(shù)范圍內,。

　　由表1可見,，采用定時器硬件計數(shù)捕獲輸入法測定的誤差在個位數(shù)范圍內，也在本系統(tǒng)允許誤差范圍內,，證明定時器硬件計數(shù)設計是合理的,，適合系統(tǒng)需求。

　　3.2 試劑實物測試

　　本系統(tǒng)整機測試流程為：開機自檢校正,、取樣,、混合、測量,、讀數(shù),，如表2所示,。

　　光電倍增管需要高壓供給，其供電電壓應跟隨靈敏度而改變,。若電壓太高,，增益噪聲呈倍數(shù)增長，會影響數(shù)據(jù)準確性,；若電壓太低,，檢測不出低含量的微生物。為此可通過調節(jié)供電電壓,，尋找合適的靈敏度,。表3列出了在不同電壓下，光電倍增管捕獲光子數(shù),，即RLU值,。

　　從表3可以看出，樣機在電壓調至850 V以上出現(xiàn)噪聲,，1 310 V以內噪聲RLU小于20,；電壓越大時，儀器靈敏度越高,，本系統(tǒng)選用1 250 V為常態(tài)下測量電壓,，如果靈敏度太高，噪聲將影響測試數(shù)據(jù)準確性,。使用者可以根據(jù)待測品的性質，在測試前進入調試界面調整輸入電壓,。

　　對不同濃度的待測品,，0.5 mL體系下的線性與靈敏度測試結果如表4所示。

　　檢測靈敏度為10-14 mol ATP,，在測試范圍內有近線性關系,。ATP含量若低于10-14 mol的級別，本儀器無法精準測量,。

　　在0.5 mL體系下的線性與靈敏度曲線如圖6所示,。

　　0.3 mL體系下的線性與靈敏度測試結果見表5。

　　0.3 mL體系下的線性與靈敏度曲線見圖7,。

　　樣機變壓電源可調電壓上限為1 310 V,，在測試范圍內，電壓與RLU成正比,。以中等發(fā)光試劑測試,，最高檢測靈敏度為ATP 10-18 mol，但在ATP濃度低于10-16 mol時,，可信度較低（重復性差）,。

　　在測試范圍內，ATP的量與RLU有較好的線性關系，線性拐點出現(xiàn)在ATP10-14 mol～10-15 mol之間,；在可調電壓范圍內,，空機噪聲低于30 RLU，通常在10～25之間上下波動[10],。

　　本系統(tǒng)測試所用樣液為標準ATP溶液,，向該溶液滴入熒光素酶，ATP能量定量轉換為光能,，所以該系統(tǒng)在交付時,，除了儀器本身以外，還需要配套化學試劑,。本系統(tǒng)采用廣東省微生物研究所研制的發(fā)光試劑盒,，可在各類水、飲料和相關食品中應用,，一次測量在30 s以內,，整個測量過程不到30 min。測試結果與美國儀器對比,，在可測量范圍內結果相近,，且穩(wěn)定、重復性高,。

　　表6給出了本儀器的性能指標,。

　　最后，對本儀器的相關性能與傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法進行了比較,，如表7所示,。

4 總結

　　從測試數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，ATP含量和細胞數(shù),、發(fā)光值RLU都存在線性關系,，測定熒光信號的強度，便可得知待檢目標被細菌,、食物殘渣等污染的程度,，因此檢測ATP可以作為判斷食物潔凈的指標。

　　系統(tǒng)基本符合預定的設計目標和效果,，可快速檢測樣品中微生物含量,，具有測定周期短、效率高,、判斷標準清晰以及測量范圍寬（10-7 mol～10-16 mol）等特點,。

　　同時，與傳統(tǒng)的檢測方法相比,，基于測量ATP濃度來間接確定微生物含量的方法能滿足測試覆蓋率高達80%以上的微生物種類,，可廣泛應用于政府監(jiān)督部門,、第三方檢測機構、食品加工行業(yè),、食品和原材料分銷商,、飯店、賓館食品操作間,、醫(yī)院等領域,。

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