摘要：生物超弱發(fā)光是生物系統(tǒng)在生命活動(dòng)中的微弱發(fā)光現(xiàn)象。為了準(zhǔn)確測(cè)量生物超弱發(fā)光,，設(shè)計(jì)了一種用于生物超微弱發(fā)光的專用采集系統(tǒng),。系統(tǒng)的激發(fā)光源由單只大功率LED及光學(xué)系統(tǒng)構(gòu)成，用壓控恒流源調(diào)整LED光照強(qiáng)度,，通過電子快門精確控制光探測(cè)器的采集時(shí)間,。測(cè)量金心吊蘭葉片的延遲發(fā)光結(jié)果表明，該系統(tǒng)測(cè)量精度高,、重復(fù)性好,。
關(guān)鍵詞：生物超弱發(fā)光；檢測(cè),；電子快門,；壓控恒流源
O 引言
生物超弱發(fā)光是生物在生命活動(dòng)過程中，輻射出的一種極其微弱的光子流,，分為自發(fā)發(fā)光和延遲發(fā)光?，F(xiàn)在已經(jīng)證明，它與生理代謝,、光合作用和細(xì)胞分裂等等許多生命過程有關(guān),，并且對(duì)環(huán)境極為敏感。由于生物超弱發(fā)光蘊(yùn)涵著豐富的生命信息,，對(duì)其探測(cè),、分析與解讀是近十幾年來(lái)許多領(lǐng)域共同關(guān)心的課題。目前,，已有不少研究,，展示出其在揭示生命運(yùn)轉(zhuǎn)機(jī)理以及農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護(hù),、醫(yī)療,、食品衛(wèi)生等許多領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。由于生物超弱發(fā)光的強(qiáng)度較弱,，且延遲發(fā)光衰減很快,，其采集涉及到外來(lái)激發(fā)光的精確控制和微弱自體發(fā)光的實(shí)時(shí)測(cè)量，至今未見成熟的專用儀器，給研究帶來(lái)困難,。鑒于此,，本文開發(fā)了一類利用LED激發(fā)的生物超弱發(fā)光采集系統(tǒng)，將LED激發(fā)光源,、電子快門和光探測(cè)器整合在一起,，通過單片機(jī)精確控制激發(fā)光源的光照時(shí)間與電子快門的開啟時(shí)間，使超弱發(fā)光尤其是延遲發(fā)光重復(fù)性測(cè)量的精度大大提高,。
1 系統(tǒng)總體設(shè)計(jì)
該系統(tǒng)測(cè)量生物超弱發(fā)光的時(shí)域信息,，采用單光子計(jì)數(shù)探測(cè)系統(tǒng)。主要包括激發(fā)光源,、光源驅(qū)動(dòng)電路,、快門控制模塊、光探測(cè)器,、數(shù)據(jù)采集與處理模塊,、溫度控制模塊、暗室和計(jì)算機(jī),。系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)如圖1所示,。
樣品放在暗室中測(cè)量，隔絕外界光線影響,。單只大功率超高亮度LED發(fā)出的光經(jīng)過透鏡變換為平行光后,，均勻照射到樣品上，中控模塊的單片機(jī)精確控制光強(qiáng)和輻照時(shí)間,，溫度控制器保持樣品處于恒溫狀態(tài),，快門驅(qū)動(dòng)模塊按照預(yù)設(shè)程序控制電子快門的開閉，PMT進(jìn)行生物發(fā)光的采集,。
2 系統(tǒng)硬件設(shè)計(jì)
2．1 主控制電路
主控電路負(fù)責(zé)整個(gè)系統(tǒng)的正常運(yùn)行,，進(jìn)行光照時(shí)間、光照強(qiáng)度和快門開閉的控制,，結(jié)構(gòu)框圖如圖2所示,。主要包括微處理器、壓控電流源,、光照時(shí)間控制,、快門開關(guān)控制,、LCD顯示,、鍵盤接口和溫度控制模塊。
2．2 激發(fā)光源及其驅(qū)動(dòng)電路
生物體的自發(fā)發(fā)光強(qiáng)度較穩(wěn)定,，而延遲發(fā)光隨時(shí)間衰減很快,，若將樣品用激發(fā)光源在暗室外照射后再拿進(jìn)暗室測(cè)量，光照結(jié)束時(shí)間和測(cè)量開始時(shí)間的間隔很難控制，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技能要求較高,。如果采用光源內(nèi)置的方法,，就能很好地解決這個(gè)問題。
系統(tǒng)采用單只大功率發(fā)光二極管(LED)作為激發(fā)光源,，通過透鏡變換為平行光,，保證樣品受光面的光強(qiáng)均勻分布。激發(fā)光源采用藍(lán)色LED,，中心波長(zhǎng)為467nm,，帶寬為20nm，可以滿足一般實(shí)驗(yàn)要求,。也可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求,，將藍(lán)色LED更換為紅色、綠色和紫色等顏色的LED,。
對(duì)LED光強(qiáng)的控制通過改變注入LED的電流大小來(lái)實(shí)現(xiàn),。為了保證實(shí)驗(yàn)的精度，要保證LED驅(qū)動(dòng)電流的恒流性,，還要使得電路的電流大小可調(diào),，實(shí)現(xiàn)光源亮度的調(diào)節(jié)。因此,，系統(tǒng)選用精密數(shù)控大功率電流源電路作為L(zhǎng)ED的驅(qū)動(dòng)電路,。電路的原理圖如圖3所示。
驅(qū)動(dòng)電路主要由微處理器,、液晶顯示與鍵盤輸入,、數(shù)／模轉(zhuǎn)換與模／數(shù)轉(zhuǎn)換、壓控恒流源,、差動(dòng)放大電路等子模塊組成,。
2．2．1 壓控恒流源
壓控恒流源是LED驅(qū)動(dòng)電路的重要組成部分，它的功能是通過調(diào)節(jié)控制電壓來(lái)達(dá)到對(duì)電流的控制,，它的性能決定了LED亮度的穩(wěn)定程度,。壓控恒流源的電路如圖4所示，U1B和R8,，R9構(gòu)成電壓跟隨器,，運(yùn)放的高輸入阻抗，近似可以認(rèn)為U1B沒有分流作用,，則流經(jīng)V2的電流全部流入負(fù)載RL,，并且有V3=V2。U1C和電阻R10,，R11,，R12構(gòu)成反相器,，有V4=-V3=-V2。U1A和電阻R1,，R2,，R3，R13構(gòu)成反向加法器電路,，輸入信號(hào)分別為Vi和V4,，輸出電壓V1=-(Vi+V4)，又因?yàn)閂4=-V2,，所以輸出電壓V1=-(Vi-V2),。運(yùn)放UB1并無(wú)分流作用，因此電阻Rm兩端的電壓為Vm=V1-V2=-Vi,，流經(jīng)Rm和負(fù)載RL的電流相等,，都為I=Vm／Rm=-Vi／Rm?？梢钥闯?，負(fù)載上的電流由輸入電壓Vi和電阻Rm共同決定，只要這兩個(gè)量不變,，電流就會(huì)保持恒定,。通過改變數(shù)模轉(zhuǎn)換器的輸出電壓，即可調(diào)節(jié)負(fù)載RL上的電流,。
負(fù)載RL是大功率的LED,，所需要的驅(qū)動(dòng)電流一般在0～300 mA，為了保證恒流電路的功率輸出,，加入了電流擴(kuò)展電路,。該擴(kuò)展電路采用簡(jiǎn)單常用的圖騰柱式電流擴(kuò)展方法。功率三極管使用大功率的2N1346,，同時(shí)連接散熱片并加裝散熱風(fēng)扇,，以保證電路穩(wěn)定工作。
2．2．2 差動(dòng)放大電路
輸出電流經(jīng)采樣電阻Rm采樣,，接入差動(dòng)放大電路的輸入端,。在電流源電路中，采樣電阻的精確程度和溫度穩(wěn)定性直接關(guān)系到電流輸出的穩(wěn)定性,。因此系統(tǒng)中采樣電阻使用精密金屬膜電阻,，該電阻溫漂小于5x10-5℃-1，阻值為2 Ω,，額定功率為10 W,。
差動(dòng)放大電路使用較常用的儀用放大器，電路原理如圖5所示,。
儀用放大電路具有較高的輸入阻抗,，能夠避免采樣電路對(duì)電流源的影響；同時(shí)又具有較大的共模抑制比,，保證采樣的準(zhǔn)確性,，避免干擾。由于采樣電阻Rm上流經(jīng)的電流變化范圍是0～300 mA,，范圍較大,，所以將差動(dòng)放大電路的放大倍數(shù)設(shè)置為1。
2．2．3 數(shù)／模和模／數(shù)轉(zhuǎn)換
數(shù)／模轉(zhuǎn)換采用C8051F021單片機(jī)內(nèi)部集成的DAC1,，DAC的輸出在每次中斷時(shí)根據(jù)A／D的采樣值計(jì)算后進(jìn)行更新,。
模／數(shù)轉(zhuǎn)換采用單片機(jī)內(nèi)部集成的12位逐次逼近寄存器型ADC。A／D和D／A的電壓基準(zhǔn)VREF由片外的LM336基準(zhǔn)穩(wěn)壓源提供,。
2．3 快門控制
為了防止LED光強(qiáng)對(duì)PMT造成損傷,，在樣品室與PMT之間加裝了電子快門來(lái)保護(hù)PMT。開啟LED時(shí),，快門關(guān)閉,；激發(fā)光源照射樣品結(jié)束時(shí)，LED熄滅,，快門打開,，PMT開始采集樣品的發(fā)光。由于延遲發(fā)光快速衰減,，為了保證能夠及時(shí)采集延遲發(fā)光,，該系統(tǒng)采用的電子快門的響應(yīng)時(shí)間為1μs，快門驅(qū)動(dòng)電壓為(12±O．1)V,，電路接通則快門開啟,，斷開則快門自動(dòng)關(guān)閉，控制簡(jiǎn)單,。但電子快門對(duì)電壓穩(wěn)定度要求較高,，需要采用單獨(dú)的穩(wěn)壓電源供電，否則有可能因電壓波動(dòng)造成快門意外關(guān)閉,。
電子快門驅(qū)動(dòng)電路如圖6所示,，開關(guān)管連接單片機(jī)P2．7口，由單片機(jī)控制快門的開啟和關(guān)閉,。當(dāng)單片機(jī)P2．7口輸出為“0”時(shí),，快門關(guān)閉；當(dāng)單片機(jī)P2．7口輸出為“1”時(shí),，快門打開,。用示波器測(cè)量驅(qū)動(dòng)電路的延遲時(shí)間在1μs以內(nèi)，考慮到快門的延遲也在1μs,，可以認(rèn)為快門總體的延遲對(duì)測(cè)量的影響可以忽略,。
3 系統(tǒng)軟件設(shè)計(jì)
系統(tǒng)軟件部分采用模塊化設(shè)計(jì)方法,，將整個(gè)程序劃分為若干模塊，通過主程序?qū)Ω鱾€(gè)子模塊的調(diào)用,，將模塊連接成一個(gè)完整的程序,。
根據(jù)系統(tǒng)控制功能的要求，確定了系統(tǒng)軟件的主要功能有：系統(tǒng)初始化,，寄存器設(shè)定,，鍵盤設(shè)定初始值(光照時(shí)間，快門開啟時(shí)間,，流過LED的電流值大小),，液晶顯示控制，電子快門控制,。根據(jù)軟件的功能要求,，圖7給出程序總體流程結(jié)構(gòu)圖，圖8表示各模塊之間的邏輯關(guān)系,。
4 儀器測(cè)試
系統(tǒng)硬件連接完成,，軟件調(diào)試通過后。接著對(duì)儀器進(jìn)行了測(cè)試,。
4．1 光源測(cè)試
使LED驅(qū)動(dòng)電路的電流在O～300 mA范圍變化,，測(cè)試LED的發(fā)光強(qiáng)度。測(cè)出驅(qū)動(dòng)電流與光強(qiáng)的關(guān)系如圖9所示,。
4．2 暗噪聲測(cè)試
圖10使用本系統(tǒng)測(cè)試的本底值,，測(cè)量時(shí)的溫度為24℃，積分時(shí)間為0．5 s,，PMT加載負(fù)高壓1 000 V,。由圖10可見，暗室的背景噪聲在50 c／s(counts persecond)之下,，計(jì)算得出本底噪聲的平均光子計(jì)數(shù)為27．48 c／s,，結(jié)果較為理想。
4．3 樣品測(cè)試
完成系統(tǒng)的研制后,，對(duì)金心吊蘭葉片的生物光子輻射延遲發(fā)光進(jìn)行檢測(cè),。首先將樣品放入暗室中黑暗處理5 min，而后用藍(lán)色LED光源光照1 min,，測(cè)量其延遲發(fā)光衰減曲線,，測(cè)量時(shí)間50 s，間隔1 s,，重復(fù)測(cè)量三次,，探測(cè)結(jié)果如圖11所示。分別對(duì)三組測(cè)量數(shù)據(jù)之間的相關(guān)度進(jìn)行擬合,，結(jié)果表明,，三組測(cè)量數(shù)據(jù)之阿的相關(guān)系數(shù)均接近O．999(見圖12(a)～(c)),，結(jié)果表明該系統(tǒng)測(cè)量具有良好的可重復(fù)性，測(cè)量精度高,。
5 結(jié)語(yǔ)
本文設(shè)計(jì)了用于測(cè)量生物超弱發(fā)光的專用測(cè)量系統(tǒng),，系統(tǒng)的激發(fā)光源由單顆高亮度大功率LED及光學(xué)系統(tǒng)構(gòu)成，用壓恒流源調(diào)整LED光照強(qiáng)度,，通過電子快門精確控制光探測(cè)器的采集時(shí)間，暗室的背景噪聲在50 c／s之下,。應(yīng)用本系統(tǒng)測(cè)量金心吊蘭葉片的延遲發(fā)光的結(jié)果表明,，該系統(tǒng)測(cè)量精度高、重復(fù)性好,，得到了較理想的測(cè)量結(jié)果,。